截葉鐵掃帚水部位促胃腸動力作用的研究

梁生林，顏峰光，李慶耀

井岡山大學醫學部，吉安 343009

截葉鐵掃帚Lespedezacuneata(Dum.-Cours.)G.Don為豆科胡枝子屬植物，又名夜關門、鐵馬鞭、三葉公母草、魚串草，以根和全株入藥。分布于江西、福建、廣東、廣西、江蘇、漸江、河南、湖北、四川、貴州和云南等省區。性平，味甘、微苦。具清熱利濕，消食除積，祛痰止咳的功效，可用于消化不良，小兒疳積，胃腸炎，細菌性痢疾，胃痛，黃疸型肝炎，咳嗽，支氣管炎等治療[1]。截葉鐵掃帚含黃酮類、酚酸類、木脂素類、甾體類、萜類等化合物[2,3]，具有保肝、抗菌、抗炎、抗氧化等多種生物活性[2]。但有關截葉鐵掃帚胃腸促動作用的研究尚未見報道。在前期研究中，發現截葉鐵掃帚水提和醇提物均具有明顯胃腸促動作用，進一步用不同極性溶劑對截葉鐵掃帚水提液進行萃取，并在離體家兔空腸管上進行預試，結果發現截葉鐵掃帚水提液萃取后的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位中，只有水部位具有明顯促進腸收縮作用。因此，本研究主要觀察了截葉鐵掃帚水部位對在體胃排空和腸推進運動、離體胃腸平滑肌收縮的促進作用；為追蹤截葉鐵掃帚促胃腸動力活性的物質基礎，將截葉鐵掃帚水部位上大孔樹脂進一步分離并評價各組分的體內外促胃腸運動。通過檢測活性組分用藥后小鼠血清胃動素(MTL)、生長激素釋放肽(ghrelin)和血管活性腸肽(VIP)含量變化；以及能否逆轉阿托品、去甲腎上腺素和異丙腎上腺素對離體空腸管收縮的抑制作用，以初步探究其胃腸促動作用的機制。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

昆明種小鼠，SPF級，體質量18～22 g，雌雄各半，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號 SCXK(湘)2011-0003。小鼠喂養在恒定溫度23±1 ℃、每12 h規律地明/暗交替的環境中，自由飲水和進食，實驗前小鼠至少需要5天的適應環境時間。豚鼠，SPF級，體質量180～250 g，雌雄不拘；中國白兔，體質量2～3 kg，雌雄不拘，均由南昌大學實驗動物部提供，實驗動物許可證號 SCXK(贛)2014-0005。截葉鐵掃帚采于江西吉安，經井岡山大學醫學部藥學教研室周秋貴副教授鑒定為豆科胡枝子屬植物截葉鐵掃帚Lespedezacuneata(Dum.-Cours.)G.Don的全草；莫沙必利片，成都康弘藥業集團股份有限公司，規格5 mg/片，批號111102；硫酸阿托品注射液，天津金耀氨基酸有限公司，規格1 mL∶0.5 mg，批號1501071；重酒石酸去甲腎上腺素注射液，天津金耀氨基酸有限公司，規格1 mL∶2 mg，批號1606071；鹽酸異丙腎上腺素注射液，上海禾豐制藥有限公司，規格2 mL∶1 mg，批號41150101；小鼠胃動素(MTL)ELISA測試盒、小鼠生長激素釋放肽(ghrelin)ELISA測試盒，均購于上海士鋒生物科技有限公司；小鼠血管活性腸肽(VIP)ELISA檢測試劑盒，由上海樊克生物科技有限公司提供；D101大孔樹脂，購于河北滄州寶恩材料有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

RE-52A旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；H1850R高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；A590紫外/可見分光光度計，翱藝儀器(上海)有限公司；BIO-RAD680酶標儀，美國Bio-Rad公司；RM6240微機生物信號采集處理系統，張力換能器，成都儀器廠；CP214電子天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司。

2 實驗方法

2.1 截葉鐵掃帚水部位及其各洗脫組分的制備

稱取干燥截葉鐵掃帚500 g，第1次加12倍的蒸餾水用文火煎煮1 h，第2、3次各加10倍的蒸餾水分別煎煮0.5 h，合并3次煎出液，靜置，過濾，取濾液，濃縮至500 mL。將500 mL截葉鐵掃帚水提液裝于1 000 mL分液漏斗中，分別以500 mL石油醚、乙酸乙酯、正丁醇為溶劑進行萃取，反復多次，直至萃取液無色為止，正丁醇萃取后的剩余部分回收溶劑后得水部位浸膏65.26 g。取32.63 g水部位浸膏，溶于500 mL蒸餾水中，取經預處理的D101大孔樹脂500 g，裝入層析柱中至柱高為85 cm，將溶于500 mL蒸餾水的水部位，以1 mL/min的流速通過大孔樹脂柱吸附，依次用蒸餾水和20%、40%、60%、95%各濃度乙醇洗脫，洗脫體積為1 000 mL，將洗脫液用旋轉蒸發儀減壓蒸干，得水洗脫組分22.0 g、20%乙醇洗脫組分3.75 g、40%乙醇洗脫組分1.95 g、60%乙醇洗脫組分0.4 g、95%乙醇洗脫組分0.275 g。用時均用蒸餾水溶解配制成濃度為15或30 mg/mL的原液。

2.2 小鼠胃排空和小腸推進運動實驗

參考文獻[4,5]方法，168只雌雄各半小鼠，按體質量和性別隨機均分為14組：模型組(蒸餾水10.00 mL/kg)，莫沙必利(0.003 g/kg)陽性對照組，截葉鐵掃帚水部位、水洗脫組分和20%、40%、60%、95%乙醇洗脫組分高、低劑量組。截葉鐵掃帚給藥劑量參考《全國中草藥匯編》成人每日用量25～50 g[1]，按動物與人體的每千克體質量等效劑量折算系數(12倍)換算成小鼠的劑量，截葉鐵掃帚水部位及各洗脫組分的給藥劑量按萃取量相當于生藥量的比例進行換算。小鼠均ig給藥，給藥容量均為10 mL/kg，1次/天，連續給5天藥。第4天灌藥后禁食不禁水20 h，末次灌藥后1 h，小鼠均灌胃給予半固體營養糊(羧甲基纖維素2.5 g放入62.5 mL蒸餾水中，加熱攪拌溶解后，分別加入奶粉4 g，糖2 g，淀粉2 g，碳素墨水1 mL，每加一次攪拌均勻，配成75 mL約75 g的黑色糊狀物)，每只0.5 mL，20 min后脫頸處死小鼠，剪開腹腔，用細線在胃賁門和幽門處分別結扎，迅速從胃賁門處至回腸末端分離胃腸，輕輕剝離腸系膜后，在不過度用力牽拉的情況下將胃腸鋪直于白色實驗臺上，用尺子測量幽門到黑色半固體糊前沿的距離和幽門到回盲部的小腸全長，計算小腸推進率。再剪下胃，用濾紙把胃拭干后稱全重，然后沿胃大彎縱行剪開胃，把胃內容物洗去，拭干后稱凈重，計算胃內殘留率。

胃內殘留率=(胃全重-胃凈重)/灌服半

固體糊重量×100%

小腸推進率=幽門到黑色半固體糊前沿的

距離/幽門到回盲部小腸全長×100%

2.3 離體平滑肌收縮性實驗

2.3.1 豚鼠離體胃底、胃竇環行肌及胃體縱行肌肌條制備

將禁食不禁水24 h豚鼠擊頭致死，打開胸腹，取出胃，置于預冷的Krebs液，沿胃大彎剪開胃腔，用預冷的Krebs液漂洗干凈。找到胃底，用剪刀按環行肌纖維走向剪取寬長0.5 cm×1.5 cm的肌條，去除粘膜，兩端用線結扎，一端連于浴管固定鉤上，放入盛有15 mL Krebs液(Krebs液應在每次實驗前新鮮配制)的麥氏浴管中，另一端連在張力換能器上，給予肌條1 g左右的前負荷。離體胃竇環行肌條：找到胃竇，用剪刀按環行肌纖維走向剪取寬長0.5 cm×1.5 cm的肌條；離體胃體縱行肌條：找到胃體，用剪刀按縱行肌纖維走向剪取寬長0.5 cm×1.5 cm的肌條；其他操作同胃底肌條。

2.3.2 家兔離體空腸管制備

將禁食不禁水24 h家兔擊頭致死，立即剖腹。取長約10 cm的空腸一段，迅速放入盛有冷Tyrode’s液的器皿中。將腸系膜及脂肪組織等剪去，將腸內容物沖洗干凈。洗凈腸腔后將腸管剪成1.5～2 cm長數段置于通有95%O2+5%CO2混合氣體的Tyrode’s液中備用。取一小段腸管置于盛有Tyrode’s液的培養皿中，在其兩端對角壁處用縫針穿線打結，一端固定在浴管固定鉤上，放入裝有20 mL Tyrode’s液的麥氏浴管中，另一端連接于張力換能器上，給予腸管2 g左右的前負荷。

2.3.3 離體平滑肌收縮性測定

參考文獻[6]方法，恒溫浴槽水溫穩定在37±0.5 ℃，張力換能器與RM6240微機生物信號處理系統連接。通以95%O2+5%CO2混合氣體，氣體流量調至浴管中氣泡一個個逸出(1～2個/s為宜)。胃底、胃竇和胃體肌條實驗：待離體胃肌條收縮活動穩定30 min后開始實驗。截葉鐵掃帚水部位及其各洗脫組分從12.5 μL開始以2倍的累積濃度方式加入浴管，如原濃度為15 mg/mL組分加入到15 mL浴管，則終濃度分別為12.5、25、50、100、200 μg/mL，實驗時先記錄一段正常收縮曲線，每次給藥后記錄胃肌條活動曲線5 min。兔空腸管實驗：待空腸管收縮活動穩定30 min后開始實驗。截葉鐵掃帚水部位及其各洗脫組分也是采用累積方式向浴管中加入藥物，實驗時先記錄一段正常收縮曲線，每次給藥后記錄空腸管活動曲線5 min，并按照下式計算收縮活動力：收縮活動力=收縮幅度×收縮頻率。在阿托品、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素對抗實驗中，先分別加入上述三種藥物，孵育3 min，再加入終濃度為9.375 mg/mL的截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分(通過前面兔離體空腸管實驗可知，9.375 mg/mL對離體空腸管的收縮作用最強，因而用該濃度來進行對抗實驗)。

2.4 小鼠血清MTL、ghrelin和VIP含量測定

取48只小鼠，雌雄各半，按性別和體質量隨機均分為4組：模型組(蒸餾水10.00 mL/kg)，莫沙必利(0.003 g/kg)陽性對照組，截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分高、低劑量組。小鼠均ig給藥，給藥容量均為10 mL/kg，1次/天，連續給5天藥。末次給藥后1 h摘眼球取血，室溫靜置2 h，于4 ℃ 3 000 rpm離心10 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存備用。血清MTL、ghrelin 和VIP含量測定均按試劑盒說明書進行操作。

2.5 統計學處理

3 結果與分析

3.1 截葉鐵掃帚水部位及其各洗脫組分對小鼠胃排空、小腸推進運動的影響

與模型組比較，莫沙必利(0.003 g/kg)組、截葉鐵掃帚水部位及20%乙醇洗脫組分高、低劑量組均使胃內殘留率顯著降低(P<0.01)。與莫沙必利組比較，截葉鐵掃帚水部位及20%乙醇洗脫組分高劑量組差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表1。與模型組比較，莫沙必利(0.003 g/kg)組、截葉鐵掃帚水部位及20%乙醇洗脫組分高、低劑量組均明顯促進小腸運動，小腸推進率明顯高于模型組(P<0.01，P<0.05)。與莫沙必利組比較，截葉鐵掃帚水部位及20%乙醇洗脫組分高、低劑量組差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表1。

表1 截葉鐵掃帚水部位及各洗脫組分對小鼠胃排空、小腸推進運動的影響

3.2 截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分對小鼠血清MTL、ghrelin 和VIP含量的影響

截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分高、低劑量組，明顯升高小鼠血清MTL、ghrelin含量，明顯降低小鼠血清VIP含量，與模型組比較，差異顯著(P< 0.01)；莫沙必利組也明顯升高小鼠血清MTL、ghrelin含量和明顯降低小鼠血清VIP含量，與模型組比較，差異顯著(P<0.01)。結果見表2。

表2 截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分對小鼠血清MTL、ghrelin和VIP的影響

3.3 截葉鐵掃帚水部位及其各洗脫組分對豚鼠胃底環行肌的作用

截葉鐵掃帚水部位400 μg/mL和20%乙醇洗脫組分25 μg/mL時，胃底環行肌收縮波幅度最大，收縮頻率和收縮張力也明顯提高，與給藥前比較差異顯著(P<0.01)。水洗脫組分400 μg/mL胃底環行肌收縮波幅度、收縮頻率和收縮張力與給藥前比較無明顯差異(P>0.05)。結果見表3。

表3 截葉鐵掃帚水部位及各洗脫組分對豚鼠胃底環形肌的作用

3.4 截葉鐵掃帚水部位及其各洗脫組分對豚鼠胃竇環行肌的作用

截葉鐵掃帚水部位400 μg/mL和20%乙醇洗脫組分400 μg/mL時，胃竇環行肌收縮波幅度最大，收縮頻率也明顯提高，與給藥前比較差異顯著(P<0.01，P<0.05)。水洗脫組分400 μg/mL胃竇環行肌收縮波幅度、收縮頻率和收縮張力與給藥前比較無明顯差異(P>0.05)。結果見表4。

表4 截葉鐵掃帚水部位及各洗脫組分對豚鼠胃竇環行肌的作用

3.5 截葉鐵掃帚水部位及其各洗脫組分對豚鼠胃體縱行肌的作用

截葉鐵掃帚水部位400 μg/mL和20%乙醇洗脫組分100 μg/mL時，胃體縱行肌收縮波幅度最大，收縮頻率增加，與給藥前比較差異顯著(P<0.01)。水洗脫組分400 μg/mL胃體縱行肌收縮波幅度、收縮頻率和收縮張力與給藥前比較無明顯差異(P>0.05)。結果見表5。

表5 截葉鐵掃帚水部位及各洗脫組分對豚鼠胃體縱行肌的作用

3.6 截葉鐵掃帚水部位及其各洗脫組分對家兔離體空腸平滑肌的影響

截葉鐵掃帚水部位150 μg/mL和20%乙醇洗脫組分9.375 μg/mL時，家兔離體空腸管收縮幅度最大，收縮頻率加快，收縮活動力也明顯增加，與給藥前比較差異顯著(P<0.01，P<0.05)。水洗脫組分300 μg/mL空腸管收縮幅度、收縮頻率和收縮張力與給藥前比較無明顯差異(P>0.05)。結果見表6。

表6 截葉鐵掃帚水部位及各洗脫組分對家兔離體空腸管的作用

3.7 阿托品對截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分所致的家兔離體空腸管收縮的影響

在20 mL Tyrode’s液中滴加終濃度為9.375 mg/mL的截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分，空腸管收縮幅度、收縮頻率明顯增加，與給藥前比較，差異顯著(P<0.01，P<0.05)；收縮張力稍有提高，但與給藥前比較差異無統計學意義(P>0.05)。在20 mL Tyrode’s液中滴加阿托品至濃度為1×10-6mol/L，可見空腸管收縮幅度明顯降低，與給藥前比較，差異顯著(P<0.01)；3 min后在阿托品基礎上再滴加終濃度為9.375 mg/mL的截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分，空腸管收縮幅度明顯增加，與阿托品比較，差異顯著(P<0.01)，與單用20%乙醇洗脫組分比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表7。

表7 阿托品對截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分所致的家兔離體空腸管收縮的作用

3.8 去甲腎上腺素對截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分所致的家兔離體空腸管收縮的影響

在20 mL Tyrode’s液中滴加終濃度為9.375 mg/mL的截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分，空腸管收縮幅度明顯增加，與給藥前比較，差異顯著(P<0.01)；收縮頻率、收縮張力稍有提高，但與給藥前比較差異無統計學意義(P>0.05)。在20 mL Tyrode’s液中滴加去甲腎上腺素至濃度為1×10-6mol/L，可見空腸管收縮幅度明顯降低，收縮張力明顯下降，與給藥前比較，差異顯著(P<0.01)；3 min后在去甲腎上腺素基礎上再滴加終濃度為9.375 mg/mL的截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分，空腸管收縮幅度明顯增加，收縮張力明顯提高，與去甲腎上腺素比較，差異顯著(P<0.01)，達到了給去甲腎上腺素前水平，但收縮幅度遠低于單用截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分水平(P<0.01)。結果見表8。

表8 去甲腎上腺素對截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分所致的家兔離體空腸管收縮的作用

3.9 異丙腎上腺素對截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分所致的家兔離體空腸管收縮的影響

在20 mL Tyrode’s液中滴加終濃度為9.375 mg/mL的截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分，空腸管收縮幅度明顯增加，與給藥前比較，差異顯著(P<0.01)；收縮頻率、收縮張力稍有提高，但與給藥前比較差異無統計學意義(P>0.05)。在20 mL Tyrode’s液中滴加異丙腎上腺素至濃度為1×10-6mol/L，可見空腸管收縮幅度明顯降低，收縮張力明顯下降，與給藥前比較，差異顯著(P<0.01)；3 min后在此基礎上再滴加終濃度為9.375 mg/mL的截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分，空腸管收縮幅度和收縮張力無明顯變化，與異丙腎上腺素比較無統計學意義(P>0.05)。結果見表9。

表9 異丙腎上腺素對截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分所致的家兔離體空腸管收縮的作用

4 討論與結論

功能性消化不良(functional dyspepsia，FD)是臨床常見的胃腸疾病之一，其患病率較高，西方國家為10%～40%，亞洲國家為5%～30%[7]；我國FD的發病率為18%～45%，占消化科門診的20%～50%[8]；且FD病情反復發作遷延不愈，嚴重影響了人們的身體健康和生存質量。功能性消化不良，其主要病理變化是胃腸動力障礙[9]，胃腸動力障礙主要表現為胃排空延遲、腸傳輸減慢[10,11]，因而促進胃排空、腸蠕動在功能性消化不良的治療中發揮重要作用。但是目前臨床上促胃腸動力藥存在療效不佳或副反應嚴重的問題[12]，因此研發新的促胃腸動力藥具有重要意義。

本實驗發現截葉鐵掃帚水部位及其20%乙醇洗脫組分ig給藥能使小鼠胃內殘留率顯著減少，小腸推進率明顯增加，表明截葉鐵掃帚水部位具有顯著促進在體小鼠胃排空、腸推進運動的作用，且促進胃排空、腸推進運動的活性組分是20%乙醇洗脫組分。

胃底環行肌節律性收縮和胃體縱行肌向前推進運動，以及胃竇環行肌節律性收縮，能促進胃排空；小腸管壁環行肌節律性收縮促進小腸分節運動，縱行肌的向前推進運動促進小腸蠕動[4]。本實驗截葉鐵掃帚水部位及其20%乙醇洗脫組分能使離體豚鼠胃底、胃竇環行肌和胃體縱行肌收縮波幅度增加，收縮頻率加快，這表明截葉鐵掃帚水部位能使胃底、胃竇環行肌和胃體縱行肌收縮運動加強，以促進胃排空。同時也能促進離體家兔空腸管收縮幅度增加、收縮活動力增強。

MTL是啟動胃腸收縮活動的腦腸肽，是評價胃腸動力的敏感指標[13]。在消化間期呈周期性釋放，通過作用于腸胃神經系統的MTL神經元，引發胃腸道消化間期移行性復合運動(migrating motor complex，MMC)Ⅲ相的發生，引起胃強烈的收縮，促進胃排空，加快小腸明顯分節運動，使內容物向小腸遠端傳遞[14-16]。故血漿MTL水平升高，胃腸運動加速，腸內容物通過加快[17]。Ghrelin主要由胃底黏膜泌酸腺細胞分泌，分布于胃腸道和中樞神經系統，與其受體結合后通過中樞和外周途徑加速胃腸運動，也是目前公認的具有促進胃腸運動的腦腸肽[18,19]。VIP廣泛分布于腸道和神經系統，是一類對胃腸運動有抑制作用的神經肽，可以延緩胃排空、減慢小腸運動[20]。本實驗證明，截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分能升高小鼠血清MTL、ghrelin含量，降低小鼠血清VIP含量，這表明截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分促進胃排空、腸推進運動的作用機制可能與促進MTL、ghrelin的產生和減少VIP的生成有關。

胃腸平滑肌具有M膽堿受體和α、β2腎上腺素受體，通過興奮M受體或抑制α、β2受體通路，可引起胃腸平滑肌收縮，張力增強，收縮幅度加大。本實驗顯示，阿托品對截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分收縮空腸管作用無影響，去甲腎上腺素對截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分收縮空腸管作用有一定的拮抗作用，異丙腎上腺素對截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分收縮空腸管作用具有明顯拮抗作用，這表明截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分胃腸促動作用可能與胃腸M受體無關，與抑制胃腸β受體通路有關，部分與α受體通路抑制具有一定的關系。

綜上所述，截葉鐵掃帚水部位能明顯促進胃腸運動，其促進胃腸運動的活性組分是20%乙醇洗脫組分。截葉鐵掃帚含有黃酮類、酚酸類、木脂素類、甾體類、萜類等，尤其是酚酸類化合物，極性較多，可被D101大孔樹脂吸附，本實驗20%乙醇洗脫組分的促胃腸運動成分很可能是上述類型中含有酚羥基、羧基等極性基團的化學成分。下一步的研究將進一步明確截葉鐵掃帚水部位20%乙醇洗脫組分的主要成分，對其更深入的研究，以為開發出治療功能性消化不良或胃腸動力障礙性疾病的新藥提供理論基礎。