西藏凹乳芹根、葉提取物的急性及亞急性毒性研究

占 堆，魏榮銳，馬勤閣，何軍偉，多杰加，仁增平措，色 珍

1西藏藏醫藥大學，拉薩 850000；2江西中醫藥大學，南昌 330004

西藏凹乳芹(Vicatiathibeticade Boiss.)在四川、云南、西藏等地有分布[1]，其根被稱為西歸，常作為中藥當歸的代用品，其性溫，味辛、甘、微苦，具有祛風除濕、散寒止痛，民間用于健脾補胃、血虛所致的月經不調、痛經、貧血等癥，西藏凹乳芹根的使用有百余年的歷史，在燉雞、燉肉時常被作為滋補蔬菜食用[2]。近年研究表明，西藏凹乳芹根含有傘形花內酯、佛手苷內酯、阿魏酸、芹菜素等化學成分，具有抗疲勞、抗痛經、抗氧化、促智、提高免疫力等藥理作用[3-7]。西藏凹乳芹根可做藥食兩用，又有很多藥理作用，具有廣闊的開發應用前景，而鮮有對西藏凹乳芹葉的研究報道，也未見對西藏凹乳芹根、葉的相關毒性研究的報道，限制了西藏凹乳芹根及葉的深度開發和利用。因此對西藏凹乳芹根、葉的提取物進行急性毒性和亞急性毒性研究，為西藏凹乳芹根及葉的開發利用及安全性評價提供毒理學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

西藏凹乳芹根、葉均采集于西藏山南市洛扎縣卡曲鄉，經西藏藏醫藥大學藏藥專家占堆鑒定為傘形科凹乳芹屬植物西藏凹乳芹(V.thibetica)的根及葉(西藏藏醫藥大學，標本編號：XZARQGY-201810)。

西藏凹乳芹根、葉提取物的制備：取西藏凹乳芹根、葉干品，粉碎后，分別加入3倍量的95%乙醇浸泡后加熱回流提取三次，每次3小時，過濾，合并三次藥液，旋轉蒸發濃縮成稠膏。使用時用蒸餾水配制成最大濃度(能通過12號小鼠灌胃針的最大濃度)，濃度以提取物濃度計算，西藏凹乳芹根、葉提取物藥液最大濃度分別為1.00和0.85 g/mL，存于4 ℃冰箱備用，后續實驗所用的不同濃度的藥液，可用此濃度的藥液進行稀釋。

1.2 實驗儀器

粉碎機(浙江紅景天工貿有限公司，型號：DE-200g)；KQ-5200DB 型超聲清洗機(昆山市超聲波儀器公司)；電子天平(十萬分之一，賽多利斯，Sarturious BT 124S型)；BUCHI電動旋轉蒸發儀(瑞士步琪公司)；Millipore-Simplicity 純水儀。制冰機(中科美菱低溫科技有限責任公司，型號：IMS-40)；電子秤(上海正光醫療儀器有限公司，型號：YP20002)；移液器(RAININ Pipet-lite XLS)。

1.3 實驗動物

SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體重(18～22 g)購于江西中醫藥大學實驗動物中心。實驗動物許可證編號SCXK(贛)2018-0003。

1.4 實驗方法

1.4.1 LD50測定

預實驗取預先配制好的最大濃度的西藏凹乳芹根或葉提取物溶液，以小鼠一次給藥的較大體積(40 mL/kg)灌胃，給藥后嚴密觀察，并每天記錄小鼠毛色及外觀，活動狀態及大小便，死亡以及中毒等情況，如果在給予最大濃度最大體積后，小鼠全部死亡，則進行后續LD50測試。測出引起動物100%死亡的最小給藥劑量(Dm)和0%死亡的最大給藥劑量(Dn)，然后根據預實驗得出的Dm和Dn算出LD50測試需要設定的給藥組數和組間比值，一般為5～7個劑量組，組間比為1∶0.80～1∶0.95，另外設1個空白組，每組10只，雌雄各半[8-10]。試驗前禁食不禁水16 h，根據預試驗設計劑量灌胃給藥，空白組給予蒸餾水，灌胃給藥1次。給藥后，連續觀察14天，記錄小鼠外觀，行為活動狀態，排泄情況，中毒癥狀，死亡時間，死亡小鼠主要臟器外觀以及死亡數量。最后根據實驗結果用改進寇氏法{LD50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)]}計算LD50和95%可信限。

1.4.2 亞急性毒性試驗方法

取50只昆明種小鼠，隨機均勻分5組，每組10只，分別為西藏凹乳芹根高、低劑量組、西藏凹乳芹葉高、低劑量組和對照組，高低劑量均為LD50(生藥量)的1/20和1/40，灌胃給藥，每天1次，連續21天，期間觀察小鼠表現及中毒情況，記錄大鼠體重及攝食量變化[11]，末次給藥后24 h稱體重，眼眶取血清測定血液生化指標，解剖取各臟器，肉眼觀察組織變化，對主要臟器肝、脾、胸腺及腎稱重，計算臟器指數。

1.5 數據分析

2 結果與分析

2.1 西藏凹乳芹根提取物急性毒性效應

2.1.1 西藏凹乳芹根提取物LD50實驗結果

根據預實驗得出引起動物100%死亡的最小給藥劑量為207.42 g/kg和0%死亡的最大給藥劑量為108.28 g/kg，因此選取給生藥量108.28～207.42 g/kg之間進行LD50測試，每組劑量以1.00∶0.85遞減，按小鼠體重計算用藥量。給藥組別及劑量如下表。共設計5個給藥組，1個空白組，各組劑量設置見表1。

表1 西藏凹乳芹根提取物組劑量表

小鼠灌胃后，空白組小鼠活動正常，毛色光澤，飲食及大小便正常，未見異常狀態；各劑量組灌胃后均出現活動減少，瞇眼，俯臥不動的情況，其中高劑量組小鼠均出現步履蹣跚、后肢癱瘓、呼吸急促、抽搐，24 h后開始出現死亡，死亡主要集中在3天內；中間劑量組149.86 g/kg灌胃后出現瞇眼，精神不振，后肢無力，呼吸急促，其死亡主要集中在2天內；低劑量組(108.28 g/kg)無小鼠死亡，為不引起小鼠死亡的最大劑量，因此MTD為108.28 g/kg。具體小鼠死亡情況見表2。根據小鼠死亡數量，用改進寇氏法計算西藏凹乳芹根提取物的LD50為154.81 g/kg，95%可信限為143.09～167.50 g/kg

表2 各組小鼠死亡情況

2.1.2 小鼠剖檢結果

實驗期間對死亡小鼠進行解剖發現：胃壁完整，胃腸內容物為藥物顏色，心肺正常，未見出血點、壞死灶；肝顏色暗紅呈顆粒狀，無明顯腫脹，腎臟顏色正常，呈顆粒狀，其它臟器未見明顯異常。實驗結束后對小鼠進行解剖發現：胃壁完整，胃內容物和胃壁正常，心肺正常，未見出血點及壞死灶；肝、腎臟顏色正常，但個別小鼠肝、腎可見呈輕微顆粒狀，其它臟器未發現異常。

2.1.3 西藏凹乳芹根提取物對小鼠肝腎功能、臟器指數、攝食量曲線和體重變化的影響

與空白組(control)相比，西藏凹乳芹根(VTBR)組(108.28 g/kg)的AST、ALT的血清含量存在上升趨勢，但無明顯差異，血清肌酐(Cr)含量具有明顯升高趨勢(圖1)，而BUN有明顯降低趨勢，提示108.28 g/kg給藥量可能引起小鼠肝腎功能紊亂，此結果與解剖發現的小鼠肝、腎有肉眼可見顆粒狀變化結果一致。另外，與空白組相比，西藏凹乳芹根組對脾臟指數，腎臟指數、胸腺指數、肝臟指數無明顯影響(圖2)。由西藏凹乳芹根組和空白組的體重變化曲線和攝食量變化曲線可知(圖3)，西藏凹乳芹根組平均體重低于空白組平均體重，但攝食量略高于空白組，可能與西藏凹乳芹根提取物影響機體代謝有關，但具體原因還有待于進一步研究。

圖1 西藏凹乳芹根提取物對小鼠肝腎功能生化指標的影響

圖2 西藏凹乳芹根提取物對小鼠各臟器指數的影響

圖3 西藏凹乳芹根提取物對小鼠體重及攝食量的影響

2.2 西藏凹乳芹葉提取物急性毒性效應

2.2.1 西藏凹乳芹葉提取物LD50實驗結果

根據預實驗得出引起動物100%死亡的最小給藥劑量為99.55 g/kg和0%死亡的最大給藥劑量為32.62 g/kg，因此選取給生藥量99.55～32.00 g/kg之間進行LD50測試，每組劑量以1.00:0.80遞減，按小鼠體重計算用藥量。各組劑量設置如表3，共設計6個給藥組，1個空白組。

表3 西藏凹乳芹葉提取物組劑量表

各組灌胃后，空白組小鼠活動正常，毛色光澤，飲食及大小便正常，未見異常狀態；各給藥組均表現為小鼠行動遲緩，臥伏，雙目微閉，自發性活動減少，精神萎靡，30 min后部分小組出現拉稀，口鼻中有分泌物現象，且劑量越大，情況越嚴重。同時高劑量組30 min后開始出現死亡，并且死亡前抽搐，而其余組小鼠死亡之前表現為四肢無力，癱臥不動，呼吸急促且微弱，隨著藥物劑量增大，死亡數量越多，死亡時間越短。其中高劑量組99.55 g/kg灌胃給藥后1 h就有小鼠死亡，死亡主要集中在1 h內；中間劑量組50.97和63.71 g/kg死亡主要集中在2 h；低劑量組(32.62 g/kg)無小鼠死亡，為不引起小鼠死亡的最大劑量，因此MTD為32.62 g/kg，具體情況見表4。根據各組小鼠死亡數量用改進寇氏法計算西藏凹乳芹葉提取物的LD50為58.27 g/kg，95%可信限為51.36～66.11 g/kg。

表4 各組小鼠死亡情況

2.2.2 小鼠剖檢結果

試驗期間對死亡小鼠進行解剖發現：胃壁完整，胃內容物為黑青色(與藥液顏色同)，心肺正常，未見出血點、壞死灶；肝顏色正常呈顆粒狀，無明顯腫脹，腎臟顏色正常呈顆粒狀、腸內容物呈黑青色，其它臟器未見明顯異常，小鼠死亡后解剖情況大致相同。實驗結束后對小鼠進行解剖發現：胃壁完整，胃內容物和胃壁正常，心肺正常，未見出血點及壞死灶；肝、腎臟顏色正常，但個別小鼠肝腎有肉眼可見輕微顆粒狀，其它臟器未發現異常。

2.2.3 西藏凹乳芹葉提取物對小鼠肝腎功能、臟器指數、攝食量曲線和體重變化的影響

與空白組相比，西藏凹乳芹葉組(西藏凹乳芹葉MTD組)的AST、ALT、Cr及BUN均有升高趨勢，其中BUN顯著性升高(圖4)，提示灌胃量32.62 g/kg可能使小鼠肝腎損傷，此結果與解剖發現的小鼠肝腎有肉眼可見顆粒狀變化結果一致。另外，與空白組相比，西藏凹乳芹葉組對脾臟指數、腎臟指數、胸腺指數無明顯影響，但可明顯升高肝臟指數(圖5)，這也與解剖發現的西藏凹乳芹葉組小鼠肝臟有肉眼可見顆粒狀變化一致。由西藏凹乳芹葉組和空白組的體重變化曲線和攝食量變化曲線可知(圖6)，兩組平均體重變化及攝食量趨勢基本一致，說明西藏凹乳芹葉提取物在最大耐受劑量32.62 g/kg時不影響小鼠的體重和攝食量。

圖4 西藏凹乳芹葉提取物對小鼠肝腎功能生化指標的影響

圖5 西藏凹乳芹葉提取物對小鼠各臟器指數的影響

圖6 西藏凹乳芹葉提取物對小鼠體重及攝食量的影響

2.3 西藏凹乳芹根、葉提取物對小鼠亞急性毒性結果

2.3.1 小鼠一般情況及剖檢結果

各組小鼠在試驗期間活動正常，毛發光澤、二便無異常。實驗結束后，對各組小鼠大體解剖顯示：胃壁完整，胃內容物正常，肺未見出血點及壞死灶，心、腦、肝、胸腺、脾、腎等組織未見異常。

2.2.3 西藏凹乳芹根、葉提取物對小鼠肝腎功能、臟器指數、攝食量曲線和體重變化的影響

與空白組相比，西藏凹乳芹根、葉各組的肝腎功能指標(AST、ALT、Cr及BUN)、肝臟指數、脾臟指數、腎臟指數及胸腺指數均無明顯差異(P>0.05，圖7和8)。另外，由西藏凹乳芹根、葉各組的體重變化曲線和攝食量變化曲線可知，各組平均體重及攝食量變化趨勢基本一致(圖9)，說明西藏凹乳芹根高、低劑量組(7.74和3.87 g/kg)和西藏凹乳芹葉高、低劑量組(2.91和1.45 g/kg)長期給藥并不影響小鼠肝腎功能、臟器指數，也不影響體重和攝食量，長期重復服用未出現毒性反應。

圖9 西藏凹乳芹根、葉提取物對小鼠體重及攝食量的影響

圖7 西藏凹乳芹根、葉提取物對小鼠肝腎功能生化指標的影響

3 討論

本研究首先對西藏凹乳芹根、葉提取物進行急性毒性實驗，根據實驗數據，采用改良寇氏法得出西藏凹乳芹根提取物的LD50為154.81 g/kg，95%可信限為143.09～167.50 g/kg；西藏凹乳芹葉提取物的LD50為58.27 g/kg，95%可信限為51.36～66.11 g/kg。目前對中藥毒性的分級尚無統一定論，孫文燕[12]在《中藥毒性分級概況與研究思路探討》中的中藥急性毒性分級中顯示LD50>15 g/kg為無毒物質，西藏凹乳芹根、葉提取物LD50均遠遠大于15 g/kg，均可判定為無毒物質。在試驗過程中，發現西藏凹乳芹根、葉提取物不引起小鼠死亡的最大耐受量MTD分別為108.28 g/kg和32.62 g/kg，在此劑量雖不引起動物死亡，但通過解剖觀察肝腎病理變化、生化指標檢測、體重及攝食量變化發現西藏凹乳芹根、葉提取物均可引起肝腎功能損傷，另外，西藏凹乳芹葉在MTD時對小鼠體重及攝食量均無影響，而西藏凹乳芹根在MTD時可使小鼠體重降低，攝食量反而增加，這可能與西藏凹乳芹根影響小鼠機體代謝有關，但具體機制還需要進一步研究。

圖8 西藏凹乳芹根、葉提取物對小鼠各臟器指數的影響

西藏凹乳芹根、葉在最大耐受量時均引起肝腎功能損傷，為觀察其長期食用是否會有毒性反應，進一步做亞急性毒性實驗，其結果顯示：各組小鼠一般情況及臟器大體解剖未見異常；體重、攝食量、臟器指數與對照組相比差異均無統計學意義；各劑量組肝、腎功能生化指標與對照組相比也無明顯差別，未發現西藏凹乳芹根、葉長期服用有毒性反應。因此，本研究未觀察到西藏凹乳芹根、葉提取物有明顯的急性經口毒性和亞急性毒性，在試驗劑量范圍內有較高的安全性，為西藏凹乳芹根、葉的開發利用提供毒理學依據。