基于熱圖和聚類(lèi)分析的毛冬青18種無(wú)機(jī)元素間的相關(guān)性研究

劉 媛，李 敏，陳驍鵬，葉 慧，白鋼鋼，仇雅靜，姚 鑫*，姜 瑋*

1蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，蘇州 215006；2泰州市食品藥品檢驗(yàn)所，泰州 225300

毛冬青又名茶葉冬青、密毛假黃楊和密毛冬青，屬冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬植物毛冬青(IlexpubescensHook.et Arn.)的干燥根，是我國(guó)常用中藥材，藥用價(jià)值較高。毛冬青中活性成分主要是三萜類(lèi)、酚酸類(lèi)、木脂素類(lèi)成分，具有抗血栓[1]、降血壓[2]、抗炎[3]、保護(hù)心腦血管組織[4,5]的作用，在臨床上主要用于治療冠心病、血栓閉塞性脈管炎、缺血性腦中風(fēng)、慢性腎炎、小兒急性上呼吸道感染等疾病。中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的核心除了中藥活性成分之外，藥材中微量元素的探索亦是重要方向，有研究證實(shí)藥材中一些無(wú)機(jī)元素不僅直接參與體內(nèi)調(diào)節(jié)，還與其藥用活性成分產(chǎn)生協(xié)同作用，增強(qiáng)臨床療效[6]。但是隨著科技的進(jìn)步、工業(yè)的發(fā)展，重金屬及有害元素極大威脅著中藥材生長(zhǎng)環(huán)境，對(duì)其藥材質(zhì)量造成了極大的損害，更對(duì)服用中藥材的人體帶來(lái)了潛在的威脅。所以，考察中藥材中無(wú)機(jī)元素的含量，是全面考察中藥材質(zhì)量的必要手段之一。

中藥材的重金屬測(cè)定方法主要有原子吸收光譜法(AAS)，原子熒光光譜法(AFS)，電感耦合等離子體光譜法(ICP-AES)，電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)等。由于ICP-MS靈敏度高、線性范圍寬、抗干擾能力強(qiáng)、分析速度快、同時(shí)測(cè)定元素多等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為國(guó)內(nèi)外普遍采用的一種痕量元素分析工具。由于毛冬青產(chǎn)地覆蓋面廣，各地生長(zhǎng)環(huán)境相差較大，市售飲片炮制過(guò)程又不統(tǒng)一，造成藥材質(zhì)量參差不齊，關(guān)于毛冬青藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)目前主要集中在皂苷類(lèi)[7]和黃酮類(lèi)[8]等活性成分，對(duì)無(wú)機(jī)元素研究報(bào)道為零。本實(shí)驗(yàn)采用ICP-MS 法對(duì)毛冬青不同產(chǎn)地8份飲片中18種無(wú)機(jī)元素進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，為傳統(tǒng)中藥的藥理毒理研究提供更科學(xué)的理論依據(jù)，為毛冬青藥材的合理應(yīng)用及安全性評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

THERMO iCAP-Q電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國(guó)THERMO公司)；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(美國(guó)MILLIPORE公司)；CEM MARSCEM MARS 240-50微波消解儀(美國(guó)CEM公司)；Mettler XS-105電子分析天平；YB-1500A型高速多功能粉碎機(jī)(永康市速峰工貿(mào)有限公司)；IKA?TUBE-MILL試管研磨機(jī)(德國(guó)IKA公司)。

1.2 試劑與試藥

試劑和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：65%優(yōu)級(jí)純硝酸(Merck公司)；超純水(Milli-Q超純水處理系統(tǒng))；Al、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Zn、Zr、Ba、Sn、Sb混合溶液(國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，批號(hào)：17B110，100 μg/mL)；Pb(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，批號(hào)：15073，1 000 μg/mL)、Cu(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，批號(hào)：14128，1 000 μg/mL)、Cd(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，1 000 μg/mL)、As(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，批號(hào)：16041，1 000 μg/mL)、Hg(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，批號(hào)：16083，1 000 μg/mL)；內(nèi)標(biāo)液：In(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，批號(hào)：13051，100 μg/mL)，Ge(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，批號(hào)：710899486-3，1 000 μg/mL)，Bi(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，批號(hào)：16031，100 μg/mL)、Sc(國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，批號(hào)：171020，1 000 μg/mL)；金標(biāo)準(zhǔn)溶液(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，批號(hào)：166660-4，1 000 μg/mL)；調(diào)諧液：17Li，59Co，89Y，140Ce，205Tl(美國(guó)Agilent公司，0.1 μg/L)；標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)黃芩(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)。

毛冬青樣品購(gòu)買(mǎi)自各個(gè)飲片生產(chǎn)企業(yè)，均經(jīng)泰州市食品藥品檢驗(yàn)所葉慧副主任中藥師鑒定為冬青科冬青屬植物毛冬青IlexpubescensHook.&Arn.的干燥根。詳細(xì)樣品信息見(jiàn)表1。

表1 不同產(chǎn)地毛冬青樣品信息

2 方法

2.1 ICP-MS 工作條件

經(jīng)優(yōu)化的ICP-MS工作參數(shù)為：等離子體射頻功率1.5 kW，冷卻氣、載氣、輔助氣流量分別為14、0.91和0.8 L/min，采樣深度5 mm，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)數(shù)為40 rpm，采用全定量分析模式。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

吸取多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用10%硝酸溶液稀釋制成含Al、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Zn、Zr、Ba、Sn、Sb質(zhì)量濃度均為1 mg/L的對(duì)照品儲(chǔ)備液。配制成含上述各元素質(zhì)量濃度分別為0、0.1×10-3、0.5×10-3、2×10-3、10×10-3、20×10-3、50×10-3、100×10-3mg/L的對(duì)照混合溶液1；吸取適量的Pb、Cu、As、Cd元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋制成分別含Pb、As、Cd元素0.5 mg/L，Cu元素2.5 mg/L的對(duì)照品儲(chǔ)備液，再精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液，用10%硝酸溶液依次稀釋?zhuān)渲瞥珊琍b、As、Cd元素質(zhì)量濃度分別為0、1×10-3、5×10-3、10×10-3、20×10-3mg/L，含Cu元素質(zhì)量濃度為0、5×10-3、25×10-3、50×10-3、100×10-3mg/L的對(duì)照混合溶液2；精密吸取Hg元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋制成0.1 mg/L的對(duì)照品儲(chǔ)備液，再用2%硝酸溶液稀釋成含元素質(zhì)量濃度為0、0.5×10-3、1×10-3、1.5×10-3、2×10-3、2.5×10-3mg/L的對(duì)照溶液3。

2.3 內(nèi)標(biāo)溶液的配制

分別精密吸取Ge、Sc、In、Bi單元素適量，用2%硝酸溶液配置成質(zhì)量濃度分別為50 μg/mL的混合對(duì)照溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4 供試品的制備

取8批不同樣品，打粉，過(guò)二號(hào)篩得粗粉，每份稱(chēng)取樣品0.5 g，置洗凈干燥的聚四氟乙烯消解罐中，精密加入硝酸5 mL，置90 ℃的加熱板上預(yù)消解30分鐘，靜置12小時(shí)后加蓋密封，裝入微波消解儀中。根據(jù)植物類(lèi)中藥材及飲片特點(diǎn)以及查閱相關(guān)資料，采取以下消解條件：第一步消解功率800 W，在10 min內(nèi)溫度由室溫升至120 ℃，保持5 min；第二步消解功率800 W，在5 min內(nèi)溫度由120 ℃升至150 ℃，保持5 min；第三步消解功率1 600 W，在20 min內(nèi)溫度由150 ℃升至180 ℃，保持5 min。消解完全后，取出消解罐，置90 ℃的加熱板上趕酸約2小時(shí)以上，待消解液冷卻至室溫。將冷卻至室溫的消解液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用少量水洗滌消解罐3次，洗滌液合并于量瓶中，加入金單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 μg/mL)200 μL，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。除不加金單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液外，同法制備試劑空白溶液。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將“2.2項(xiàng)”下的對(duì)照品混合溶液1、2，對(duì)照品溶液3，分別進(jìn)樣分析。以對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)量值(3次得數(shù)的平均值)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各元素的線性方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 18種無(wú)機(jī)元素的線性關(guān)系

2.6 檢出限的測(cè)定

取空白溶液進(jìn)行測(cè)試，連續(xù)進(jìn)樣11次，以空白溶液計(jì)算出各元素的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SA)，按QL(n=3)=3×SA/S計(jì)算檢出限，其中SA為標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。儀器檢出限指在一定的置信范圍內(nèi)能與儀器噪音相區(qū)別的最小檢測(cè)信號(hào)對(duì)應(yīng)的待測(cè)物質(zhì)的量，計(jì)算公式為DL(mg/kg)=3×SA×1/S；方法檢出限指在特定儀器條件下，以合理的置信水平測(cè)定被測(cè)物的最小濃度值，計(jì)算公式為CL(mg/kg)=3×SA×1/S×50×10-6×1/(0.5×10-3)。根據(jù)以上兩個(gè)公式計(jì)算出儀器、方法檢出限，結(jié)果18種無(wú)機(jī)元素的檢出限均能很好的滿足分析要求，見(jiàn)表3。

表3 18種無(wú)機(jī)元素的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SA)及檢出限

2.7 精密度試驗(yàn)

取將“2.2項(xiàng)”下的對(duì)照品混合溶液1和2，對(duì)照品溶液3，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄結(jié)果。可見(jiàn)各成分精密度RSD在0.67%～2.98%，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

選取毛冬青S8樣品，稱(chēng)取約0.25 g，精密稱(chēng)定，根據(jù)“2.4”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，測(cè)定，計(jì)算，可見(jiàn)各成分重復(fù)性RSD在0.58%～3.59%。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

選取毛冬青S8樣品，稱(chēng)取約0.25 g，精密稱(chēng)定，按照“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、8、10、12 h測(cè)定，計(jì)算各無(wú)機(jī)元素RSD值，結(jié)果見(jiàn)表2。可見(jiàn)各成分穩(wěn)定性RSD在1.56%～4.02%。

2.10 加樣回收率

選取毛冬青S8樣品，稱(chēng)取0.25 g，精密稱(chēng)定，加入混合對(duì)照品溶液，按照“2.4”項(xiàng)下的方法制備加樣回收率溶液，扣除本地值后，用ICP-MS測(cè)定各元素的回收率，各元素的回收率為82.4%～110.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～11.7%。

3 結(jié)果

3.1 樣品測(cè)定

采用上述微波消解法-ICP-MS法，精密稱(chēng)取8批毛冬青飲片各0.5 g，按照上述方法進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)內(nèi)標(biāo)校正的標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中18種無(wú)機(jī)元素的含量，結(jié)果見(jiàn)圖1、表4。

表4 不同產(chǎn)地毛冬青樣品中18種無(wú)機(jī)元素測(cè)定結(jié)果

圖1 不同產(chǎn)地毛冬青中無(wú)機(jī)元素含量對(duì)比圖

3.2 無(wú)機(jī)元素的相關(guān)性分析

中藥材中無(wú)機(jī)元素的分析，可采用相關(guān)性分析用以衡量不同元素之間是否具有協(xié)同或者拮抗作用。本研究采用SPSS 23.0 軟件對(duì)毛冬青中18種無(wú)機(jī)元素進(jìn)行相關(guān)性分析，采用皮爾孫相關(guān)系數(shù)法(該方法主要用于度量?jī)蓚€(gè)變量之間的相關(guān)程度)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5，統(tǒng)計(jì)結(jié)果共有6對(duì)元素顯著性負(fù)相關(guān)(P<0.01)，4對(duì)元素負(fù)相關(guān)(P<0.05)；79對(duì)元素顯著性正相關(guān)(P<0.01)，60對(duì)元素正相關(guān)(P<0.05)。如：As與V和Sb均呈極顯著性正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.835(P<0.01)和0.867(P<0.01)；Cu與Cd、Pb及Zn均呈極顯著性負(fù)相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為-0.812(P<0.01)、-0.915(P<0.01)和-0.839(P<0.01)。

表5 不同產(chǎn)地毛冬青中18種無(wú)機(jī)元素的皮爾遜相關(guān)性分析

3.3 無(wú)機(jī)元素的熱圖和聚類(lèi)分析

熱圖(heat map)是近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于數(shù)據(jù)挖掘的方法之一，其原理是在聚合大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，以一種漸進(jìn)的藍(lán)紅色帶直觀的將結(jié)果展現(xiàn)出來(lái)，借此可以看出數(shù)據(jù)的疏密和頻率高低程度，以及重點(diǎn)研究對(duì)象的地區(qū)差異變化。本文通過(guò)根據(jù)8批不同產(chǎn)地毛冬青18種無(wú)機(jī)元素各自的比值，利用Image GP網(wǎng)頁(yè)制圖工具繪制熱圖，見(jiàn)圖2。由圖2熱圖可見(jiàn)8批不同產(chǎn)地毛冬青樣品呈現(xiàn)出一定的聚類(lèi)性特征，可以按產(chǎn)地劃分為4類(lèi)：第Ⅰ類(lèi)為S1(江西)、S2(廣西)，這2組資源中Cd、Cr比值差異是4組類(lèi)別中最大的，值得注意的是As、Hg比值亦較高，其它常量及微量元素比值較為平均；第Ⅱ類(lèi)為S3(安徽)、S8(浙江)，這2組資源中各種無(wú)機(jī)元素較為平均，Cu比值較高；第Ⅲ類(lèi)為S4(福建)、S6(廣東)、S7(廣東)，這3組資源中Cd比值是4組類(lèi)別中第2高的，其它元素相對(duì)來(lái)說(shuō)差異不大；第Ⅳ類(lèi)為S5(海南)，這組資源中所有元素比值是4組類(lèi)別中最低的，差異均不大。由此可見(jiàn)8批毛冬青樣品中無(wú)機(jī)元素含量受不同產(chǎn)地土壤、水質(zhì)、氣候等因素的影響比較明顯。

圖2 無(wú)機(jī)元素含量的熱圖分析

4 討論

本文采用了ICP-MS法對(duì)8組資源毛冬青進(jìn)行了18種無(wú)機(jī)元素的測(cè)定，根據(jù)元素的分類(lèi)，對(duì)文中所測(cè)元素進(jìn)行分類(lèi)，人體必需微量元素為Mn、Ti、Cr、Sn、Ni、Fe、Zn，有害微量元素為Pb、Hg、As、Cd、Cu、Ba、Sb、Al，其他元素為V、Co、Zr。從表4看，人體必需微量元素Mn、Ti、Cr、Sn、Ni、Fe、Zn元素均檢出且含量不低，而Cr、Ni、V等元素有利于冠心病治療[9]，毛冬青中具有測(cè)出了不低的Cr、Ni、V元素，Cr、Ni元素測(cè)定值甚至大于2 mg/kg，這與其具有治療冠心病的作用是相符的；而Fe、Zn元素具有較強(qiáng)的活血作用，毛冬青中Fe為89.77 mg/kg，Zn為74.35 mg/kg，這與其臨床上治療血栓閉塞性脈管炎、缺血性腦中風(fēng)相符。但現(xiàn)代研究證實(shí)過(guò)量的無(wú)機(jī)元素亦會(huì)對(duì)人體造成不良影響，例如Mn過(guò)量會(huì)造成人暴躁易怒，而毛冬青中Mn檢出平均值最高，達(dá)到了118.12 mg/kg。

《中國(guó)藥典》2015年版一部規(guī)定了丹參、西洋參、黃芪、甘草等藥材中鉛不得過(guò)5 mg/kg、砷不得過(guò)2 mg/kg、鎘不得過(guò)0.3 mg/kg、汞不得過(guò)0.2 mg/kg、銅不得過(guò)20 mg/kg[10]。由表4可見(jiàn)8批毛冬青中Pb、Cd、As、Hg、Cu均檢出，平均值分別為5.85、0.05、0.033、0.012、2.11 mg/kg。與藥典規(guī)定限度比較，筆者發(fā)現(xiàn)其中毛冬青中Pb元素超出了標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限度，而過(guò)量的Pb進(jìn)入人體后，只有少量會(huì)隨著體液排除，大部分會(huì)集聚在體內(nèi)，易造成貧血、動(dòng)脈硬化等疾病。此外，藥典中未規(guī)定限度的Ba元素的測(cè)定值也較高，8批平均值為35.13 mg/kg，而B(niǎo)a元素中毒會(huì)造成心肌中毒、心律失常及嚴(yán)重低血鉀。由此可見(jiàn)，建立合適的重金屬及有害元素控制方法是迫切而必須的。

近年來(lái)，對(duì)中藥材中無(wú)機(jī)元素的測(cè)定已經(jīng)得到越來(lái)越廣泛的關(guān)注，尤其是不同產(chǎn)地中藥材無(wú)機(jī)元素含量差異較大，這從側(cè)面可反應(yīng)出我國(guó)土壤、水質(zhì)、氣候等環(huán)境因地理及科技發(fā)展帶來(lái)的差距，所以在選擇中藥材道地不道地的時(shí)候，亦需要將重金屬作為考察指標(biāo)之一[11]。減少中藥材的重金屬污染除了從源頭上防治污染以外，也可以在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下深入研究，采取合理炮制方法降低其含量。這對(duì)保證中藥材質(zhì)量，保障中藥用藥安全具有極大意義。本文對(duì)考察毛冬青藥材有效性及安全性提供了一定幫助。