土牛膝抗炎成分分離、鑒定與含量測(cè)定研究

歐陽文，羅懿釩，李 震，王雄龍，張?jiān)评ぃ苋A榮，唐純玉*，李順祥

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙 410208；2湖南時(shí)代陽光藥業(yè)股份有限公司，永州 410116；3湖南食品藥品職業(yè)學(xué)院；4湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心，長沙 410208；5湖南省抗感染中藥工程技術(shù)研究中心；6湖南時(shí)代陽光博士后科研流動(dòng)站協(xié)作研發(fā)中心，永州 410116

土牛膝別名倒鉤草、倒梗草等，來源較為復(fù)雜，包括莧科植物粗毛牛膝AchyranthesasperaLinnacus、柳葉牛膝A.longifolia(Makino)Makino及牛膝A.bidentataBlume野生種的干燥根及根莖。具有活血祛瘀，瀉火解毒，利尿通淋之功效。主治閉經(jīng)，跌打損傷，風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛，痢疾，白喉，咽喉腫痛，瘡癰，淋證，水腫[1]。“喉咽清”來源于民間驗(yàn)方，由土牛膝、馬蘭草、車前草和天名精四位藥味組成，土牛膝為君藥，具有清熱解毒和利咽止痛的功效，主要用于肺胃實(shí)熱所導(dǎo)致的咽部腫痛、發(fā)熱、口渴、便秘、扁桃體炎、咽炎等證[2]。喉咽清口服液(顆粒)為國家重點(diǎn)新產(chǎn)品和國家醫(yī)保目錄品種，在新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)防治中，于2020年2月7日被湖南省衛(wèi)生健康委員會(huì)納入《湖南省兒童新型冠狀病毒感染臨床診斷與治療專家共識(shí)(試行第一版)》，用于兒童新型冠狀病毒感染的防治，適于咽痛偏于風(fēng)熱者[3]。

土牛膝提取物具有很好的抗炎功效，Rao等[4]建立家兔聲帶炎癥模型，觀察研究了土牛膝提取物對(duì)大白兔急性咽喉炎的治療作用，結(jié)果表明土牛膝提取物可以顯著抑制家兔急性咽喉炎的癥狀。Ou等[5]研究土牛膝提取物的抗炎作用，結(jié)果表明土牛膝提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹和雞蛋清引起的大鼠足跖腫脹以及急性炎癥導(dǎo)致的腹腔毛細(xì)血管通透性均有不同程度的抑制作用。前期本課題組對(duì)土牛膝化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，已經(jīng)分得16個(gè)單體化合物，包括蛻皮甾酮類和齊墩果酸為苷元的三萜皂苷類，還分得生物堿、脂肪酸及一種新異黃酮類化合物[6,7]。以脂多糖刺激小鼠單核巨噬細(xì)胞株RAW264.7，可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種相關(guān)介質(zhì)和細(xì)胞因子如NO、tumor necrosis factor-α(TNF-α)、interleukin-6(IL-6)、cyclooxygenase-2(COX-2)等而形成炎癥細(xì)胞模型，此模型被廣泛應(yīng)用于抗炎藥物的篩選評(píng)價(jià)。NO作為眾多炎癥介質(zhì)中的重要因子之一，在調(diào)節(jié)多種生理功能方面起重要作用，例如血管擴(kuò)張、神經(jīng)傳遞和炎癥應(yīng)答等，其濃度可以用來評(píng)價(jià)炎癥反應(yīng)的強(qiáng)弱程度[8]。為進(jìn)一步明確土牛膝抗炎活性成分，本課題組建立脂多糖刺激的RAW264.7炎癥模型，分析不同土牛膝的抗炎作用，并在活性指導(dǎo)下對(duì)粗毛牛膝抗炎成分進(jìn)行分離純化，鑒定結(jié)構(gòu)并測(cè)定主要活性成分含量隨季節(jié)變化規(guī)律，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與儀器

1.1 材料

粗毛牛膝(A.asperaLinnacus)和柳葉牛膝(A.longifolia(Makino)Makino)采自湖南永州馬鞍嶺瑤家寨湖南時(shí)代陽光藥業(yè)股份有限公司種植基地，野生牛膝(A.bidentataBl.野生種)采自湖南長沙湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，懷牛膝(A.bidentataBl.)采自河南焦作東巖村，以上品種均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室王智老師鑒定，憑證標(biāo)本保存(No.2018072201(粗毛牛膝)、2018072202(柳葉牛膝)、2018072501(野生牛膝)、2018102401(懷牛膝))在湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心。

1.2 儀器與試劑

小鼠單核巨噬細(xì)胞株(RAW264.7)購于中科院上海細(xì)胞庫。竹節(jié)參皂苷IVa(PS010730)購買于成都普思生物科技股份有限公司，純度大于98%；脂多糖、地塞米松、二甲基亞砜、thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT)(美國Sigma公司)；dulbecco’s modified eagle media(DMEM)高糖培養(yǎng)基(美國gibco公司)；胎牛血清fetal calf serum(FBS)(德國pan seratech公司)；phosphate buffered saline(PBS)磷酸鹽緩沖液(hyclone公司)；NO檢測(cè)試劑盒(碧云天公司)；色譜級(jí)乙腈、甲醇、反相硅膠板(德國默克公司)；octadecysilyl-A(ODS-A)和ODS-AQ(50 μm，日本YMC公司)；柱層析硅膠(80～100目和200～300目)，薄層色譜板(青島海洋公司)；常規(guī)提取分離用試劑甲醇等均為分析純?cè)噭?長沙匯虹試劑公司)。

AL104萬分之一電子天平(梅特勒-托利多公司)；C18色譜柱(日本YMC公司)，LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；R204B3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申順科技有限公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州艾克林凈化設(shè)備有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；低速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；酶標(biāo)儀(美國Biotek公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；G2-XS QTof超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司)；INOVA-600 MHz高分辨超導(dǎo)核磁共振譜儀(瑞士Bruker公司)。

2 方法

2.1 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)[9,10]，簡述如下：將RAW264.7細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，充分吹打混勻，放入37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每日在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀況，1天更換一次培養(yǎng)基，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。另外還包括細(xì)胞傳代、細(xì)胞凍存和細(xì)胞復(fù)蘇等基本操作。

2.2 活性測(cè)試樣品的制備與分離

取不同品種土牛膝和懷牛膝粉末約30 g，分別采用10、6、4倍甲醇回流提取三次，每次提取1 h，提取液過濾并減壓濃縮和冷凍干燥得醇提取物。精確稱取各提取物樣品，DMSO完全溶解(終體積不得超過0.1%)。用完全培養(yǎng)基配制成相應(yīng)濃度的稀釋液，現(xiàn)配現(xiàn)用，用0.22 μm微孔濾器除菌后測(cè)定細(xì)胞毒性和抗炎活性。

粗毛牛膝(A.asperaL.)1.17 kg，陰干過20目篩，10倍甲醇回流提取3次，每次2 h，提取液濃縮并干燥得浸膏130 g。再將浸膏與117.5 g ODS-AQ全親水性反相硅膠攪拌，低于60 ℃水浴鍋揮干溶劑，經(jīng)ODS柱層析(4cm×10 cm)，利用甲醇-水溶液梯度洗脫，其中水、10%、30%、50%、70%、90%的甲醇-水溶液和純甲醇，丙酮分別洗脫2 L，各分離部位減壓濃縮干燥后，分別得到水洗脫物(110.5 g)、10%甲醇洗脫物(1.3 g)、30%甲醇洗脫物(2.42 g)、50%甲醇洗脫物(2.99 g)、70%甲醇洗脫物(4.37 g)、90%甲醇洗脫物(4.31 g)、100%甲醇洗脫物(3.39 g)、丙酮洗脫物(1.27 g)，各部分測(cè)定活性。

合并50%～70%甲醇洗物3.0 g，用甲醇溶解后，拌硅膠10 g并揮干溶劑，過硅膠柱層析(2 cm×20 cm)，采用二氯甲烷-甲醇(98∶2、97∶3、96∶4、95∶5、90∶10、80∶20、70∶30、2∶1、1∶1，純甲醇)梯度洗脫，共獲得40組分，其中Fr.15(二氯甲烷-甲醇90∶10洗脫)組分經(jīng)過硅膠柱層析，得到Fr.15A-E五個(gè)組分，F(xiàn)r.15B再反復(fù)通過硅膠柱，二氯甲烷-甲醇9∶1洗脫，分離得到化合物1(55 mg)和2(12 mg)；Fr.15D過ODS柱層析，40%甲醇水反復(fù)洗脫分離，得化合物3(4.7 mg)。Fr.9(二氯甲烷-甲醇95∶5洗脫)組分，先過ODS-A反相色譜柱，55%甲醇洗脫純化，并進(jìn)一步經(jīng)過硅膠柱分離(二氯甲烷-甲醇97∶3洗脫)，獲得兩個(gè)主要組分(Fr.9A和Fr.9B)，組分Fr.9A進(jìn)一步經(jīng)制備液相色譜(37%乙腈-水溶液)制備純化，獲得化合物4(7.0 mg)和5(4.4 mg)。組分Fr.9B進(jìn)一步經(jīng)制備液相色譜(37%乙腈-水溶液)制備純化，獲得化合物6(5.0 mg)和7(5.4 mg)。Fr.30(二氯甲烷-甲醇7∶3洗脫)組分，過ODS-A反相色譜柱，65%甲醇-0.1%甲酸水溶液反復(fù)洗脫純化，獲得化合物8(4.1 mg)。Fr.6(二氯甲烷-甲醇97∶3洗脫)組分，過ODS柱色譜，水-甲醇梯度洗脫得到7個(gè)亞組分Fr.6A～G，其中Fr.6B過ODS柱色譜，50%甲醇反復(fù)洗脫，得到結(jié)晶10(2.3 mg)。

100%甲醇洗脫物，經(jīng)過ODS柱色譜，90%甲醇分離，主要化合物9(11.3 mg)以結(jié)晶形式析出。

2.3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

通過分析理化性質(zhì)，采用現(xiàn)代波譜技術(shù)(1H NMR、13C NMR及MS)方法解析，并結(jié)合對(duì)照品分析比較鑒定化合物結(jié)構(gòu)。

2.4 MTT法分析樣品細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

稱取25 mg的MTT，放入10 mL的離心管中，加5 mL的PBS緩沖液，配成濃度為5 mg/mL的MTT溶液，超聲完全溶解后用0.22 μm微孔濾器除菌，4 ℃避光保存。取生長狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長期的培養(yǎng)細(xì)胞，脫壁后，用含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配制成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，以3×104個(gè)/孔，每孔100 μL接種于96孔板中，置于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)空白組、對(duì)照組和樣品組。空白組無細(xì)胞，對(duì)照組加入含細(xì)胞的100 μL DMEM培養(yǎng)基。樣品組分別加入不同濃度樣品，使終體積為100 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，再加入質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT溶液20 μL，置于CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育，4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO溶液，在培養(yǎng)板平臺(tái)震蕩機(jī)上震蕩10 min，置酶標(biāo)儀中490 nm處測(cè)定各孔吸光值(OD值)。按公式計(jì)算細(xì)胞存活率。計(jì)算公式如下：

2.5 炎癥模型中NO釋放量檢測(cè)

處于對(duì)數(shù)生長期的培養(yǎng)細(xì)胞，脫壁后，用含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為3×104個(gè)/mL，均勻接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔100 μL，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將原培養(yǎng)液棄去，設(shè)置正常組、模型組和樣品組。正常組不加LPS和樣品；模型組在培養(yǎng)液中加入LPS溶液(終濃度1 μg/mL)；樣品組為不同濃度土牛膝提取物和單體化合物的稀釋培養(yǎng)基100 μL，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h，取其上清液于離心管中。按照試劑盒說明書中的操作方法，先將培養(yǎng)基按順序加入各試劑，于波長550 nm處的酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的吸光度值(OD值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定NO釋放量(μM)。配置單體和提取物溶液時(shí)，DMSO(終體積不得超過0.1%)完全溶解，用完全培養(yǎng)基配制成相應(yīng)濃度的稀釋液，現(xiàn)配現(xiàn)用，并用0.22 μm微孔濾器除菌。

2.6 活性測(cè)試數(shù)據(jù)處理

2.7 反相液相色譜測(cè)定β-蛻皮甾酮條件

參照文獻(xiàn)[11]，島津HPLC儀(LC-20A二元高壓梯度儀，SPD-20A紫外檢測(cè)儀)，色譜柱為島津YMC C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，檢測(cè)波長250 nm，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液(16∶84，V/V)，流速為1 mL/min。

2.8 含量測(cè)定樣品制備

2.8.1 對(duì)照品的制備

精密稱取β-蛻皮甾酮2.8 mg，置于10 mL容量瓶，加色譜甲醇溶解并定容，配置0.28 mg/mL的儲(chǔ)液。精密吸取儲(chǔ)液1 mL，置于另一10 mL容量瓶，加色譜甲醇定容，即得0.028 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.8.2 供試品制備

參考文獻(xiàn)[12]，稱取藥材粗粉(過四號(hào)篩)約0.1 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶，加甲醇至刻度，超聲30 min(功率：40 kHz，100 W)，放冷后甲醇定容，過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液，精密吸取20 μL進(jìn)樣，按色譜條件分析。

2.9 方法學(xué)考察

2.9.1 線性關(guān)系

精密吸取0.028 mg/mL的對(duì)照品溶液1、2、4、8、20 μL進(jìn)樣，按色譜條件分析，按照進(jìn)樣量(ng)和β-蛻皮甾酮峰面積計(jì)算線性回歸方程。

2.9.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取β-蛻皮甾酮對(duì)照品溶液10 μL，按照色譜條件中的方法測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次。

2.9.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

分別取同一批粉末6份，按樣品溶液的制備操作，并按色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

2.9.4 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份樣品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24 h測(cè)定β-蛻皮甾酮峰面積值。

2.9.5 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收試驗(yàn)，精密吸取已知含量的柳葉牛膝粉末，加入大體相同量的對(duì)照品溶液，流動(dòng)相定容至10 mL容量瓶，過膜，微量進(jìn)樣器精密吸取20 μL按照色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。

3 結(jié)果

3.1 MTT法測(cè)定不同土牛膝甲醇提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性作用

由表1可知，柳葉牛膝和野生牛膝醇提取物在25～400 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率高，且與正常組相比，無顯著性差異(P>0.05)，而粗毛牛膝和懷牛膝提取物在濃度為400～120 0 μg/mL時(shí)，細(xì)胞均有不同程度地死亡。故本研究選取濃度為50、100、200 μg/mL進(jìn)行后續(xù)干預(yù)，測(cè)定抗炎活性。

表1 各提取物的細(xì)胞存活率

3.2 土牛膝各提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響研究

由表2可知，對(duì)照組與模型組比較，LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞時(shí)，使NO釋放量明顯增加(P<0.01)。與模型組相比，懷牛膝和不同土牛膝提取物干預(yù)時(shí)，NO釋放量均有減少，且呈劑量依賴性抑制；在濃度為200 μg/mL時(shí)，三種土牛膝的抗炎作用均強(qiáng)于懷牛膝，對(duì)比不同土牛膝醇提取物的NO釋放量發(fā)現(xiàn)，抑制作用最強(qiáng)的為粗毛牛膝，NO釋放量為12.92±0.50 μM，與模型組有極顯著差異。故進(jìn)一步對(duì)粗毛牛膝醇提取物進(jìn)行分離，測(cè)定活性。

表2 不同提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響

3.3 MTT法測(cè)定粗毛牛膝各分離部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性作用

粗毛牛膝醇提取物經(jīng)反相柱層析分離，水-甲醇梯度洗脫得到各個(gè)洗脫組分。各部分細(xì)胞毒性結(jié)果如表3所示，除去90%甲醇洗物組外，其它部位均在濃度范圍為25～200 μg/mL時(shí)無明顯細(xì)胞毒性，細(xì)胞存活率較高；在濃度為400～120 0 μg/mL時(shí)，細(xì)胞均有不同程度地死亡。故除90%甲醇洗物組外，各洗脫組分均選取濃度為50、100、200 μg/mL進(jìn)行干預(yù)，測(cè)定抗炎活性。

表3 粗毛牛膝各分離部位的細(xì)胞存活率

3.4 土牛膝各分離部位對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響研究

各洗脫部分抗炎結(jié)果如表4所示，與模型組相比，粗毛牛膝各洗脫部位作用后，NO釋放量均有減少，且呈濃度依賴性。50和100 μg/mL的濃度下，水洗物對(duì)NO釋放量無抑制作用(P>0.05)，濃度為200 μg/mL的水洗物和50、100 μg/mL的10%甲醇洗物對(duì)NO釋放量有抑制作用(P<0.05)；其他組在各濃度下對(duì)NO釋放量具有顯著抑制作用(P<0.01)。另外，30%、50%、70%、100%甲醇洗物和丙酮洗物在50、100、200 μg/mL的濃度下對(duì)NO釋放量的抑制作用均極其明顯。綜合各洗脫物得率及抗炎活性，確定50%、70%及100%甲醇洗物為重點(diǎn)分離對(duì)象。

表4 粗毛牛膝分離部位對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響

3.5 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為白色晶體;紫外光下顯暗紫色熒光，香草醛-濃硫酸反應(yīng)顯藍(lán)綠色。液質(zhì)聯(lián)用分析，給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+(481.318 1)，[M+H-2H2O]+(445.297 0)，結(jié)合文獻(xiàn)[7]和課題組前期分離對(duì)照品，確定該化合物為β-蛻皮甾酮。

化合物2為無色針狀結(jié)晶;紫外光下可見暗紫色熒光，該化合物的比移值與β-蛻皮甾酮相似，香草醛-濃硫酸反應(yīng)顯示紅色。與已知對(duì)照品比較，確定為牛膝甾酮，高效液相色譜分析顯示兩個(gè)峰。進(jìn)行超高液相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，出現(xiàn)兩個(gè)峰，質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示相同準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+(481.316 3和481.316 0)，證明兩個(gè)化合物分子式均為C27H44O7，結(jié)合文獻(xiàn)比較[13]，鑒定化合物為25-R牛膝甾酮，25-S牛膝甾酮。

化合物3為白色結(jié)晶性粉末;紫外光下可見暗紫色熒光。負(fù)離子模式ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰[M+2H2O-H]-(531.271 6)，經(jīng)過與前期分離對(duì)照品在三種高效液相色譜條件下比較，確定為水龍骨甾酮B。

化合物4白色粉末狀物質(zhì);1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.45(1H，d，J= 15.6 Hz，H-7)，7.13(1H，s，H-2)，7.07(2H，d，J= 7.8 Hz，H-2′，6′)，7.04(1H，d，J= 7.8，H-6)，6.81(1H，d，J= 7.8 Hz，H-5)，6.73(2H，d，J= 7.8 Hz，H-3′，5′)，6.42(1H，d，J= 15.6 Hz，H-8)，3.90(3H，s，3-OCH3)，3.48(2H，t，J= 7.2 Hz，H-8′)，2.77(2H，t，J= 7.2 Hz，H-7′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：169.5(s，C-9)，149.6(s，C-4)，157.2(s，C-3)，142.4(d，C-7)，128.6(s，C-1)，123.5(d，C-6)，119.0(d，C-8)，116.8(d，C-5)，111.8(d，C-2)，131.6(s，C-1′)，131.0(d，C-2′，6′)，150.1(s，C-4′)，116.6(d，C-3′，5′)，56.7(q，3-OCH3)，42.9(t，C-8′)，36.1(t，C-7′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14,15]基本一致，鑒定為N-反式阿魏酰酪胺。

化合物5為白色粉末狀物質(zhì);核磁共振氫譜和碳譜數(shù)據(jù)同化合物4基本一致，且兩者一同制備分離得到，化合物5長時(shí)間放置不太穩(wěn)定，可逐步轉(zhuǎn)化為化合物4；兩者的區(qū)別在于化合物5中δ5.83(1H，d，J= 12.6 Hz)，6.63(1H，d，J= 12.6 Hz)是一個(gè)順式雙鍵。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.38(1H，s，H-2)，6.94(1H，d，J= 7.8，H-6)，6.75(1H，d，J= 7.8 Hz,H-5)，6.63(1H，d，J= 12.6 Hz，H-7)，5.83(1H，d，J= 12.6 Hz，H-8)，3.85(3H，s，3-OCH3)，7.01(2H，d，J= 7.8 Hz，H-2′，6′)，6.70(2H，d，J= 7.8 Hz，H-3′,5′)，3.41(2H，t，J= 7.2 Hz，H-8′)，2.71(2H，t，J= 7.2 Hz，H-7′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：170.3(s，C-9)，148.5(s，C-4)，156.9(s，C-3)，138.4(d，C-7)，131.1(s，C-1)，128.5(d，C-6)，124.8(d，C-8)，115.8(d，C-5)，113.9(d，C-2)，56.3(q，3-OCH3)，131.4(s，C-1′)，130.7(d，C-2′，6′)，116.2(d，C-3′，5′)，148.5(s，C-4′)，42.3(t，C-8′)，35.5(t，C-7′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14,15]報(bào)道一致，故鑒定為N-順式阿魏酰酪胺。

化合物6白色粉末;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.79(1H，s，H-2)，6.74(1H，d，J= 7.8 Hz，H-5)，6.94(1H，d，J= 7.8 Hz，H-6)，2.73(2H，t，J= 7.2 Hz，H-7)，3.44(2H，t，J= 7.2 Hz，H-8)，7.38(1H，s，H-2′)，6.70(1H，d，J= 7.8 Hz，H-5′)，6.62(1H，m，H-6′)，6.62(1H，d，J= 12.6 Hz，H-7′)，5.84(1H，d，J= 12.6 Hz，H-8′)，3.80(3H，s，3-OCH3)，3.84(3H，s，3′-OCH3)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：131.9(s，C-1)，113.9(d，C-2)，148.5(s，C-3)，148.9(s，C-4)，124.8(d，C-5)，l16.1(d，C-6)，138.3(d，C-7)，121.5(d，C-8)，170.4(s，C-9)，128.5(s，C-1′)，113.4(d，C-2′)，146.0(s，C-3′)，148.5(s，C-4′)，122.1(d，C-5′)，115.8(d，C-6′)，36.0(t，C-7′)，42.3(t，C-8′)，56.3(q，3′-OCH3)，56.2(q，3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14,15]報(bào)道一致，故鑒定為N-順式阿魏酰-3-甲氧基酪胺。

化合物7為白色粉末狀物質(zhì);核磁共振氫譜和碳譜數(shù)據(jù)同化合物6基本一致，兩者一同制備分離得到，且化合物6長時(shí)間放置不太穩(wěn)定，可逐步轉(zhuǎn)化為化合物7；兩者的區(qū)別在于化合物7中δ6.33(1H，d，J= 15.6 Hz)，7.36(1H，d，J= 15.6 Hz)是一個(gè)反式雙鍵。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.75(1H，s，H-2)，6.68(1H，d，J= 7.8 Hz，H-5)，6.60(1H，d，J= 7.8 Hz，H-6)，2.70(2H，t，J= 7.3 Hz，H-7)，3.42(2H，t，J= 7.3 Hz，H-8)，7.05(1H，s，H-2′)，6.72(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5′)，6.95(1H，d，J= 7.8 Hz，H-6′)，7.36(1H，d，J= 15.6Hz，H-7′)，6.33(1H，d，J= 15.6 Hz，H-8′)，3.76(3H，s，3-OCH3)，3.81(3H，s，3′-OCH3)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：132.0(s，C-1)，113.4(d，C-2)，149.0(s，C-3)，149.8(s，C-4)，123.2(d，C-5)，116.4(d，C-6)，142.0(d，C-7)，118.7(d，C-8)，169.2(s，C-9)，128.2(s，C-1′)，111.5(d，C-2′)，146.0(s，C-3′)，149.3(s，C-4′)，122.3(d，C-5′)，116.1(d，C-6′)，36.2(t，C-7′)，42.4(t，C-8′)，56.3(q，3′-OCH3)，56.3(q，3-OCH3)；以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14,15]報(bào)道一致，故鑒定為N-反式阿魏酰-3-甲氧基酪胺。

化合物8通過與對(duì)照品比較，在三種不同高效液相色譜條件下分析，與竹節(jié)參皂苷Ⅳa一致，故鑒定化合物8為竹節(jié)參皂苷Ⅳa。

化合物9通過與對(duì)照品比較，在三種不同高效液相色譜條件下分析，與竹節(jié)參皂苷Ⅰ一致，故鑒定化合物9為竹節(jié)參皂苷Ⅰ。

化合物10為無色針狀結(jié)晶(甲醇)，香草醛-濃硫酸反應(yīng)顯紅色。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.93(1H，s，H-2)，7.38(1H，t，J= 8.4Hz，H-4′)，7.22(1H，d，J= 8.4Hz，H-6′)，7.05(1H，d，J= 8.4Hz，H-3′)，6.99(1H，t，J= 8.4Hz，H-5′)，6.72(1H，s，H-8)，4.59(2H，s，H-11)，3.85(3H，s，5-OCH3)，3.78(3H，s，2′-OCH3)，3.44(3H，s，11-OCH3)，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道一致，故鑒定為5，2′-二甲氧基-6-甲氧甲基-7-羥基-異黃酮。

3.6 MTT法測(cè)定不同濃度單體化合物對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性作用

選取地塞米松(dexamethasone，DXMS)為陽性對(duì)照藥物，分析10個(gè)單體的細(xì)胞毒性和抗炎活性，由表5可見，各單體化合物均在12.5～50 μM濃度范圍時(shí)對(duì)細(xì)胞無明顯毒性；在濃度為100～200 μM時(shí)，細(xì)胞均有不同程度地死亡。各單體化合物均在低于50 μM的濃度范圍內(nèi)細(xì)胞存活率較高，且與正常對(duì)照組相比，無顯著性差異(P>0.05)。故各單體化合物選取12.5、25、50 μM進(jìn)行NO釋放量檢測(cè)。

表5 不同濃度單體化合物的細(xì)胞存活率

3.7 單體化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響研究

由表6可見，與模型組相比，陽性對(duì)照藥物地塞米松(DXMS)和各單體作用時(shí)，NO的釋放量均有減少，且呈濃度依賴性降低，各濃度下均有顯著的抑制作用(P<0.01)。在LPS+25 μM單體濃度下，化合物抗炎活性強(qiáng)弱依次為4>1>5>2>6>9>10>3>7>8，化合物4(N-反式阿魏酰酪胺)抗炎活性最強(qiáng)，但綜合比較各單體抗炎活性和在提取物及原藥材含量，β-蛻皮甾酮(1)為主要抗炎活性單體。

表6 土牛膝各單體化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響

3.8 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果與分析

分別吸取對(duì)照品溶液、供試樣品溶液、樣品溶液加對(duì)照品溶液各20 μL，按“色譜條件”注入液相色譜儀測(cè)定，結(jié)果表明采用本色譜條件，β-蛻皮甾酮與相鄰峰分離度好，大于1.5，且在與對(duì)照品相同的保留時(shí)間內(nèi)，空白無干擾。

3.8.1 線性關(guān)系考察結(jié)果

β-蛻皮甾酮進(jìn)樣量在28～560 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系好，線性方程為y=840.35x-701 3.1，R2= 0.999 7。

3.8.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取5 μL對(duì)照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD，結(jié)果顯示β-蛻皮甾酮峰面積RSD為2.44%，表明儀器精密度好。

3.8.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液20 μL，分別于0、2、4、8、12、24 h注入液相色譜儀，測(cè)定待測(cè)成分峰面積并計(jì)算RSD；結(jié)果表明β-蛻皮甾酮峰面積的RSD為2.15%，表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

按樣品制備方法，平行制備6份供試品溶液，按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明β-蛻皮甾酮平均含量為0.060 4%，RSD為1.99%，說明方法重現(xiàn)性好。

3.8.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已測(cè)含量的柳葉牛膝粉末約0.1 g，置10 mL容量瓶中，精密加入用色譜純甲醇配置的對(duì)照品溶液2.5 mL(即加入β-蛻皮甾酮70 μg)，甲醇定容，按樣品制備方法制備加樣供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果如下表7所示，平均回收率為104.05%，RSD為1.54%，說明該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

表7 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.9 土牛膝不同季節(jié)蛻皮甾酮含量測(cè)定結(jié)果

對(duì)不同土牛膝和不同月份β-蛻皮甾酮含量測(cè)定，結(jié)果如下表8所示。野生牛膝(采集于湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園)和柳葉牛膝(種植基地，兩年生)地下根莖不同月份中含量差異較大，從4月到12月季節(jié)變化過程中，含量先逐漸增加，后又逐漸降低，其中8月含量最高，分別為0.914±0.016和1.412±0.038 mg/g。8月是湖南地區(qū)溫度最高季節(jié)，說明溫度高有利于次生代謝產(chǎn)物β-蛻皮甾酮的累積。粗毛牛膝(種植基地，兩年生)β-蛻皮甾酮含量隨季節(jié)變化影響不大。

表8 不同品種土牛膝不同季節(jié)蛻皮甾酮含量測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)論與討論

粗毛牛膝、野生牛膝和柳葉牛膝醇提取物均能劑量依賴性抑制NO量的釋放，其中以粗毛牛膝醇提取物抗炎效果最佳；粗毛牛膝醇提物過反相層析組分，50%、70%及100%甲醇洗脫物表現(xiàn)為細(xì)胞毒性低，抗炎活性高；進(jìn)一步經(jīng)分離鑒定，從50%～70%甲醇洗脫物分離鑒定出9種單體化合物：β-蛻皮甾酮(1)、牛膝甾酮(2)、水龍骨甾酮 B(3)、N-反式阿魏酰酪胺(4)、N-順式阿魏酰酪胺(5)、N-順式阿魏酰-3-甲氧基酪胺(6)、N-反式阿魏酰-3-甲氧基酪胺(7)、竹節(jié)參皂苷Ⅳa(8)、5，2′-二甲氧基-6-甲氧甲基-7-羥基-異黃酮(10)；竹節(jié)參皂苷Ⅰ(9)為100%甲醇洗脫物主要成分；體外抗炎結(jié)果表明，各單體在安全劑量范圍內(nèi)，均能劑量依賴性抑制NO量的釋放，在LPS+25 μM單體濃度下，化合物抗炎活性強(qiáng)弱依次為4>1>5>2>6>9>10>3>7>8，比較抗炎活性與原藥材含量，β-蛻皮甾酮(1)為主要抗炎活性單體；野生牛膝和柳葉牛膝(兩年生)地下根莖β-蛻皮甾酮含量隨季節(jié)有明顯變化，體現(xiàn)在溫度高季節(jié)含量高，溫度低含量降低；而兩年生粗毛牛膝隨季節(jié)變化規(guī)律不明顯。以上結(jié)果表明土牛膝具有顯著的抗炎作用，抗炎成分包括甾酮類、三萜皂苷、生物堿類及異黃酮類，具有抗炎活性的阿魏酰酪胺生物堿為首次從土牛膝中分離鑒定。

ODS-AQ是日本YMC公司研發(fā)的一種獨(dú)特高品質(zhì)親水性球形C18色譜填料，可用100%水系為流動(dòng)相。本實(shí)驗(yàn)中采用ODS-AQ柱對(duì)粗毛牛膝醇提取物進(jìn)行分離，首先采用純水洗脫，將糖類或糖苷類洗脫下來，本實(shí)驗(yàn)水洗物特別多，干燥后占總提取物約85%，活性測(cè)定顯示水洗物基本無抗炎活性，因此使用ODS-AQ柱對(duì)粗毛牛膝醇提取進(jìn)行活性分離是成功的。水洗后，反相ODS-AQ柱繼續(xù)用甲醇-水梯度洗脫，甲醇比例逐漸增加，洗脫成分極性也逐漸降低，活性測(cè)定顯示，抗炎活性也逐漸升高，這充分說明土牛膝中起到關(guān)鍵抗炎作用的是極性較低化合物，這與文獻(xiàn)[16]記載“土牛膝根吹末或溫酒治療，效果更佳”是一致的。項(xiàng)目前期已經(jīng)從土牛膝中分離得到了幾個(gè)吲哚類生物堿，此次又首次分離鑒定了阿魏酰酪胺生物堿類，進(jìn)一步豐富了土牛膝的化學(xué)資源庫，也提示進(jìn)一步對(duì)土牛膝極性較低組分展開化學(xué)成分研究，將得到更多活性好和有趣的化合物。

β-蛻皮甾酮是土牛膝起抗炎的主要活性成分，含量測(cè)定結(jié)果表明野生牛膝和柳葉牛膝(兩年生)地下根據(jù)含量隨季節(jié)有明顯變化，體現(xiàn)在溫度高季節(jié)含量高，溫度低含量降低，而兩年生粗毛牛膝隨季節(jié)變化規(guī)律不明顯，這可能與粗毛牛膝地下根莖粗硬，對(duì)β-蛻皮甾酮的累積影響小。在β-蛻皮甾酮含量測(cè)定，中國藥典采用水飽和正丁醇超聲提取或甲醇提取，提取液蒸干后再甲醇溶解定容，我們?cè)诓僮髦邪l(fā)現(xiàn)，提取液蒸干后，樣品變得很黏，甲醇溶解轉(zhuǎn)移后損失大。另外在甲醇超聲提取時(shí)，超聲儀的功率和超聲時(shí)間對(duì)提取影響大，超聲提取功率為40 kHz(100 W)和超聲30 min能將β-蛻皮甾酮充分提取出來。β-蛻皮甾酮結(jié)構(gòu)中含有不飽和羰基結(jié)構(gòu)，250 nm為最大吸收波長，摩爾吸收系數(shù)大，因此0.1 g藥材置于10 mL容量瓶超聲提取，提取液用濾膜過濾測(cè)定，即使藥材中蛻皮甾酮含量低至萬分之一也在線性范圍內(nèi)。