霍山石斛和鐵皮石斛干花成分含量和抗氧化性的比較

張珍林，閔運(yùn)江，黃仁術(shù)，劉莉彬，陳乃富*

1皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院；2植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心；3安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室，六安 237012

石斛是一種多年生草本中藥，其中安徽霍山是蘭科植物石斛屬產(chǎn)地之一，位于大別山區(qū)北方[1]。安徽霍山產(chǎn)石斛種類雖多，但主要以霍山石斛和鐵皮石斛兩種為主產(chǎn)，每年4～5月份或10月份是霍山石斛的花期，5～7月份或10～11月份是鐵皮石斛的花期，兩種石斛花期均較短暫。

目前研究并開發(fā)石斛的藥、食、賞價(jià)值已經(jīng)很成熟，但花作為石斛的一大亮點(diǎn)，在研究、開發(fā)利用上并沒有得到很好的發(fā)展。近幾年關(guān)于石斛花的文獻(xiàn)報(bào)道，總結(jié)有以下幾個(gè)方面，研究石斛花的物質(zhì)成分及抗氧化性，如：Miao等[2]關(guān)于超聲-醋酸法提取鐵皮石斛花總黃酮及其體外抗氧化性的研究報(bào)道；Zhang[3]、Liang[4]等關(guān)于石斛花多糖、黃酮以及藥理學(xué)研究報(bào)道；研究加工條件對石斛花品質(zhì)的影響，如：Zhang等[5]關(guān)于石斛花鼓風(fēng)干燥機(jī)理和感官品質(zhì)變化規(guī)律的研究報(bào)道；研究石斛花的揮發(fā)性成分，如：Lyu等[6]對11個(gè)鐵皮石斛雜交系鮮花的揮發(fā)性成分分析，Qu等[7]關(guān)于四種石斛花氨基酸和揮發(fā)性成分比較研究。可見，對石斛花的基礎(chǔ)研究存在一些，但并不全面，而從上述文獻(xiàn)了解，石斛花是具備成為新型食品功能因子來源的潛力，伴隨著人們對抗氧化性物質(zhì)與健康的關(guān)系認(rèn)識的發(fā)展，對石斛花進(jìn)行深加工產(chǎn)品的研究值得關(guān)注。

所以，結(jié)合前期對石斛干花干制條件的摸索和研究[5]，依托霍山石斛花干制技術(shù)規(guī)程的制定，本研究進(jìn)行了霍山產(chǎn)兩種主要石斛花的營養(yǎng)成分、活性成分以及抗氧化性的分析比較。本試驗(yàn)以霍山主產(chǎn)的霍山石斛干花和鐵皮石斛干花為原料，根據(jù)測定營養(yǎng)成分(蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素C、脂肪、總酸、多糖)、次生代謝物(多酚、黃酮、單寧)、兩種石斛干花醇提液的抗氧化性進(jìn)行分析研究。為充實(shí)石斛干花的深加工產(chǎn)品，建立完善石斛干花營養(yǎng)品質(zhì)評價(jià)體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料

實(shí)驗(yàn)材料為2018年5月初開始，分批次采自安徽省霍山縣國家基本藥物所霍山石斛原種基地，鮮花均來自根系生長3年的石斛，霍山石斛鮮花5月初(每日清晨)采收，鐵皮石斛鮮花6月初(每日清晨)采收，去雜，攤晾，遠(yuǎn)紅外鼓風(fēng)干制，-20 ℃保藏，每次按統(tǒng)計(jì)學(xué)概率取樣。經(jīng)筆者陳乃富教授鑒定分別為霍山石斛DendrobiumhuoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng、鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的花。

1.1.2 儀器

數(shù)控超聲波清洗器(KQ300DE型昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平((FA1204B上海越平科技有限公司)；高速萬能粉碎機(jī)(FW100型津市泰斯特儀器有限公司)；紫外可見分光光度計(jì)(UV2100型尤尼柯上海儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(天津市紐森科技有限公司)；氨基酸自動(dòng)分析儀(L8900型日本日立公司)。

1.2 方法

1.2.1 石斛干花營養(yǎng)成分分析方法

蛋白質(zhì)含量測定，采用凱氏定氮法；維生素C含量測定，采用2,6～二氯靛酚滴定法；總酸含量測定，采用pH電位法；粗脂肪含量測定，采用索氏抽提法；粗多糖含量測定，采用硫酸-苯酚法。

1.2.2 石斛干花活性成分分析方法

總多酚含量測定，采用酒石酸亞鐵比色法。

單寧含量測定，參照Zhao等[8]的方法并稍作修改；分別準(zhǔn)確稱取5.000 g干花粉，用80 mL水洗入100 mL容量瓶中，放入沸水浴中提取30 min，取出、冷卻、定容，吸取2.0 mL樣品提取液，離心4 min(8 000 rpm)，上清液備用。

總黃酮含量測定，參照Chang等[9]的方法并稍作修改；分別準(zhǔn)確稱取5.000 g石斛干花粉末于濾紙包中放入蒸餾瓶中，加入相應(yīng)濃度的乙醇溶液，開始熱回流提取，平行提取三次，將每次的收集液置于250 mL容量瓶中，最后用乙醇溶液定容至刻度，離心取上層清液備用。

1.2.3 石斛干花氨基酸含量測定與評價(jià)

氨基酸含量測定，參照Liu等[10]的方法并稍作修改；分別準(zhǔn)確稱取5.000 g兩種石斛干花粉，加入5 mL 4%磺基水楊酸超聲30 min，離心30 min(12 000 rpm)，取上清液備用；聯(lián)合L8900日立氨基酸自動(dòng)分析儀對試樣中的17種氨基酸成分進(jìn)行分析測定。

根據(jù)測定的氨基酸含量進(jìn)行該樣品的評價(jià)分析，參照Wei等[11]的計(jì)算方法；根據(jù)測定的氨基酸含量分別進(jìn)行氨基酸評分(AAS)、化學(xué)評分(CS)、必須氨基酸指數(shù)(EAAI)分析。

1.2.4 石斛干花抗氧化性測定方法

DPPH自由基清除能力測定參照Sarker等[12]的方法并稍作修改。分別準(zhǔn)確稱取5.000 g已過260目篩的兩種石斛干花粉置于裝有40 mL濃度70%的乙醇溶液的圓底燒瓶中，熱回流提取2 h，提取3次，每次所得提取液于250 mL容量瓶中，再用70%乙醇定容至刻度線，搖勻備用，以無水乙醇為空白，于517 nm處測定吸光度，同時(shí)以VC標(biāo)準(zhǔn)品作為對照，隨后進(jìn)行DPPH自由基清除能力的測試。清除率計(jì)算公式：清除率=[1-(A2-A1)/A0]×100%。

式中：A0：DPPH溶液和乙醇的吸光值；A1：乙醇與各濃度待測液的吸光值；A2：DPPH與各濃度待測液的吸光值。

鐵氰化鉀還原力測定參照Choochote等[13]的方法并稍作修改，獲取提取液方法同上，,以水為空白，VC為陽性對照，于700 nm測定吸光度，隨后進(jìn)行鐵氰化鉀還原力測試。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測定3次；通過單因素方差分析(one-way ANOVA)對平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及化學(xué)組分和抗氧化性間的相關(guān)性進(jìn)行顯著性比較，P<0.05表明具有差異，處理結(jié)果有顯著差異出現(xiàn)，組間的平均值顯著性再進(jìn)行Duncan多重比較；每組數(shù)據(jù)均使用平均數(shù)±相對平均標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 石斛干花營養(yǎng)成分含量和活性成分含量

安徽霍山產(chǎn)霍山石斛干花和鐵皮石斛干花的營養(yǎng)成分含量和活性成分含量結(jié)果見表1。通過表1可得到，霍山石斛干花的維生素C、粗多糖、粗蛋白、單寧、總酸的含量均高于鐵皮石斛干花，而粗脂肪含量略低于鐵皮石斛干花。從營養(yǎng)性角度來看，霍山石斛干花比鐵皮石斛干花更適合作為人補(bǔ)充維生素C和蛋白質(zhì)的良好來源。從功能性角度來看，霍山石斛干花在多酚、黃酮、單寧含量上均高于鐵皮石斛干花，且霍山石斛干花中單寧的含量比鐵皮石斛干花高33.6%，預(yù)測霍山石斛干花的抗氧化功效高于鐵皮石斛干花。霍山石斛干花除粗脂肪和粗多糖含量與鐵皮石斛干花無差異(P>0.05)，其余成分兩種石斛干花均是差異顯著(P<0.05)。

2.2 石斛干花氨基酸組成成分分析

2.2.1 石斛干花氨基酸組成成分

霍山產(chǎn)兩種石斛干花的氨基酸測定結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表2，兩種石斛干花中常見氨基酸種類全面，均檢測出17種氨基酸，兩者氨基酸含量相比，霍山石斛干花略高于鐵皮石斛干花，其中，兩種花中酪氨酸含量都為最高。根據(jù)FAO/WHO的理想模式，質(zhì)量較好的蛋白質(zhì)其 EAA/TAA為0.40左右，EAA/NEAA在0.60以上，由此可見，霍山石斛干花比鐵皮石斛干花更符合FAO/WHO的理想模式，表明其氨基酸營養(yǎng)價(jià)值高于鐵皮石斛干花。

表2 石斛干花的氨基酸含量

2.2.2 石斛干花氨基酸組成成分分析

根據(jù)表2霍山石斛干花和鐵皮石斛干花氨基酸含量結(jié)果，知道霍山產(chǎn)兩種石斛干花均含有人體必需氨基酸，依據(jù)WHO提議的必需氨基酸成人攝取模式與雞蛋氨基酸攝食模式，計(jì)算兩種石斛干花的AAS、CS、EAAI值，進(jìn)一步分析兩種石斛干花營養(yǎng)品質(zhì)，計(jì)算所得數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于表3。統(tǒng)計(jì)兩石斛干花必需氨基酸含量評分總數(shù)分別為171.42 mg/g N、192.75 mg/g N，由此得出，兩種石斛干花必需氨基酸評分總量均大于FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)的35 mg/g N和雞蛋蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的49.7 mg/g N。兩石斛干花的氨基酸評分(AAS)和化學(xué)評分(CS)比值均大于100，這表明石斛干花中必需氨基酸模式極佳，人體在攝食時(shí)消化吸收和利用沒有障礙。兩種石斛干花中的EAAI值均在100以上，均是大于FAO/WHO評分模式中同種氨基酸含量。

表3 石斛干花的AAS、CS、EAAI比較

2.3 石斛干花抗氧化活性

2.3.1 石斛干花提取液對DPPH自由基清除能力

兩種石斛干花提取液和對照品Vc對DPPH自由基清除能力如圖1所示，由圖可知，霍山石斛干花和鐵皮石斛干花提取液均具有對DPPH自由基清除能力，且清除效果和溶液濃度相關(guān)。在0.1～1.0 mg/mL之間隨著濃度的增加，對DPPH自由基清除能力逐漸增強(qiáng)。其中，計(jì)算得出霍山石斛干花提取物抗氧化的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.528 mg/mL，鐵皮石斛干花提取物抗氧化的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.604 mg/mL。

圖1 不同種類的石斛干花提取液自由基清除率效果

2.3.2 石斛干花提取液對鐵氰化鉀還原能力

通過鐵氰化鉀法測定兩種石斛干花提取液和對照品Vc的還原能力，測得數(shù)據(jù)結(jié)果如圖2。據(jù)圖2看出，霍山石斛干花和鐵皮石斛干花均具有對鐵氰化鉀的還原能力，且還原能力和濃度相關(guān)，在0.04～0.24 mg/mL的質(zhì)量濃度之間對鐵氰化鉀還原力亦是隨濃度的增加而加大，且霍山石斛干花和鐵皮石斛干花都表現(xiàn)出還原力線性關(guān)系良好，霍山石斛干花提取液對鐵氰化鉀的還原力高于鐵皮石斛干花，但還原力均比對照品Vc弱。

圖2 不同品種的石斛干花提取液還原能力效果

2.4 石斛干花成分含量與抗氧化能力的相關(guān)性分析

2.4.1 霍山石斛干花成分含量與抗氧化能力的相關(guān)性分析

對霍山石斛干花所有測定成分和抗氧化性的相關(guān)性分析見表4。查相關(guān)系數(shù)臨界值表，當(dāng)α=0.05時(shí)，r=0.606；當(dāng)α=0.01時(shí)，r=0.776得出，單寧與粗多糖正相關(guān)，多酚與粗多糖、單寧正相關(guān)，黃酮與粗蛋白、維生素C、單寧、多酚正相關(guān)，DPPH自由基清除率IC50與粗多糖、單寧、多酚、黃酮、氨基酸正相關(guān)，鐵氰化鉀還原能力與粗多糖、單寧、多酚、黃酮正相關(guān)。

表4 霍山石斛干花成分相關(guān)性分析

2.4.2 鐵皮石斛干花成分含量與抗氧化能力的相關(guān)性分析

對鐵皮石斛干花所有測定成分的相關(guān)性分析見表5。查相關(guān)系數(shù)臨界值表，同上得出，單寧與粗多糖正相關(guān)，多酚與粗蛋白、粗多糖、單寧正相關(guān)，黃酮與維生素C、單寧、多酚正相關(guān)，氨基酸與單寧正相關(guān)，DPPH自由基清除率IC50與粗多糖、單寧、多酚、黃酮正相關(guān)，鐵氰化鉀還原能力與粗多糖、單寧、多酚、黃酮正相關(guān)。

表5 鐵皮石斛干花成分相關(guān)性分析

3 討論

前人的研究發(fā)現(xiàn)，涉及石斛及石斛花的研究主要集中在單一石斛品種，如Xin等[14]對鐵皮石斛不同花期及花朵不同部位活性組分分析，只探討了不同花期鐵皮石斛花及盛花期花朵不同部位多糖、總黃酮及總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異；多個(gè)石斛品種單一物質(zhì)或多個(gè)石斛品種僅幾個(gè)部分物質(zhì)成分方面，如Zhang等[15]對石斛樣品中幾種營養(yǎng)成分的分析研究，也只是對粗灰分、全氮、全磷、鈣和鎂等5種營養(yǎng)成分分析。有關(guān)安徽霍山產(chǎn)石斛花整體物質(zhì)成分的研究鮮有報(bào)道，本次研究對霍山石斛干花和鐵皮石斛干花的粗蛋白、粗脂肪、粗多糖、維生素C、總酸、單寧、多酚、黃酮含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)霍山石斛干花中的粗蛋白、維生素C、單寧、總酸、多酚、黃酮與鐵皮石斛干花相比明顯高，且霍山石斛干花中必需氨基酸含量高于鐵皮石斛干花，這一研究結(jié)果是首次提出。

前人的研究發(fā)現(xiàn)，果蔬、花卉等由于多酚氧化酶的存會導(dǎo)致在加工過程中產(chǎn)品顏色變深，如Jiu等[16]研究熱激結(jié)合水楊酸處理對蝴蝶蘭組培褐變的影響，發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶對蝴蝶蘭組培褐變影響很大。也有前人研究烏雞的黑色素存在和酪氨酸有很大關(guān)系，如Li等[17]對日糧酪氨酸水平對0～4周齡泰和烏骨雞生產(chǎn)性能及組織黑色素含量的影響研究。還有前人研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶的存在是生物體中唯一參與黑色素合成的關(guān)鍵酶，Yan等[18]從美花石斛的莖中分離得到了12個(gè)化合物，其中有3個(gè)表現(xiàn)出良好的護(hù)膚活性，表達(dá)出酪氨酸酶抑制劑在美花石斛提取物中可以抑制酪氨酸酶活性。本研究在氨基酸測定時(shí)發(fā)現(xiàn)在兩種干花中酪氨酸含量都為最高，酪氨酸是一種多酚衍生物，可以被酪氨酸單酚酶催化，由此推斷石斛花干制后顏色會變深跟酪氨酸含量高有很大關(guān)系，對加工干制石斛花時(shí)進(jìn)行顏色品質(zhì)控制提供理論依據(jù)。

前人的研究結(jié)果表明，石斛花的抗氧化能力與總黃酮/蘆丁的含量、多糖含量成正相關(guān)[2-4]。本研究在進(jìn)行石斛干花成分含量與抗氧化能力的相關(guān)性分析時(shí)得出，霍山石斛干花和鐵皮石斛干花在顯著水平為0.05%時(shí)，抗氧化性能與多酚含量、黃酮含量、多糖含量、單寧含量、氨基酸含量均成正相關(guān)。前人在紫薯的研究中發(fā)現(xiàn)，不能單獨(dú)利用花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)解釋抗氧化能力的強(qiáng)弱，而是由多種生物活性物質(zhì)綜合決定[19]。本研究發(fā)現(xiàn)兩種石斛干花主要營養(yǎng)成分之間多是相互獨(dú)立的，在含量上沒有表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性，說明它們之間不存在潛在的關(guān)聯(lián)機(jī)制；但兩種石斛干花主要次生代謝產(chǎn)物之間表現(xiàn)出極大正相關(guān)性，單寧含量、多酚含量、黃酮含量與主要營養(yǎng)成分之間都有一定關(guān)系，且單寧含量、多酚含量、黃酮含量相互也均呈現(xiàn)正相關(guān)，表明在植物生長過程中主要營養(yǎng)成分對次生產(chǎn)物含量是有影響，因此全面準(zhǔn)確地分析霍山石斛干花和鐵皮石斛干花提取液的抗氧化性對指導(dǎo)產(chǎn)品開發(fā)利用具有重要價(jià)值。

4 結(jié)論

霍山產(chǎn)霍山石斛干花和鐵皮石斛干花均具有均衡的營養(yǎng)成分和活性成分，但霍山石斛干花中的粗蛋白、維生素C、單寧、總酸、多酚、黃酮含量明顯較高，且霍山石斛干花中必需氨基酸含量高于鐵皮石斛干花，對DPPH自由基清除效果及鐵氰化鉀的還原能力也是霍山石斛干花表現(xiàn)出強(qiáng)抗氧化能力。鑒于霍山石斛干花具有豐富的營養(yǎng)成分、活性成分及較強(qiáng)的抗氧化活性，可以作為石斛花新品和天然抗氧化劑資源進(jìn)行開發(fā)利用，成為補(bǔ)充人體所需營養(yǎng)來源的一種理想原料。