三種七葉一枝花活性成分抗新型冠狀病毒的分子對接預測

司 淵，王 糾，張 亮，劉雪文，劉 瑩,,4*

1湖北醫藥學院 基礎醫學院；2湖北醫藥學院 胚胎干細胞湖北省重點實驗室；3湖北醫藥學院 武當特色中藥研究湖北省重點實驗室；4湖北醫藥學院 生物醫藥研究院，十堰 442000

2019年12月，新型冠狀病毒SARS-CoV-2在湖北省武漢市迅速爆發[1]。截至2020年6月22日，我國共有85 018例新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)確診病例，其中死亡患者4 646例。其后，美國、意大利、西班牙、英國、法國、德國、伊朗、瑞士、韓國、日本等全球200多個國家也報道了超過897萬例感染病例。感染SARS-CoV-2的患者的常見癥狀是發燒，咳嗽和肌痛或疲勞[2,3]。SARS-CoV-2的S蛋白和SARS-CoV的S蛋白結構相似，并且均對人細胞表面的血管緊張素轉化酶(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)具有顯著的結合親和力，通過ACE2的介導進入人體。ACE2在肺，消化道，腎臟等組織細胞中廣泛表達，目前認為是SARS-CoV-2進入宿主細胞的關鍵[4,5]。臨床治療表明，傳統中藥結合西藥對COVID-19具有顯著的治療效果[6]。到目前為止，對COVID-19的治療還缺乏特效藥。因此，迫切需要找到有效的抗病毒藥物來遏制這種疾病。

百合科重樓屬植物七葉一枝花(Parispolyphylla)又名蚤休、草河車、白甘遂，其根莖稱為重樓。重樓作為中草藥藥用歷史悠久[7,8]，有抗炎、止血、殺菌、鎮靜、止痛、平喘、止咳的作用，民間還用于治療各種瘡毒、癰疽、毒蛇咬傷等[9,10]。20世紀70年代以來，關于重樓中的活性成分的研究一直在繼續。目前，已在重樓中發現了上百種化學成分，其中有70多種為甾體皂苷類化合物。而重樓中含量較多的甾體皂苷類化合物異包括螺甾烷醇類的薯蕷皂苷和偏諾皂苷。重樓皂苷I(polyphyllin I)、重樓皂苷VI(polyphyllin VI)和重樓皂苷VII(polyphyllin VII)均屬于薯蕷皂苷(圖1)，在重樓中含量豐富，廣泛用于多種疾病治療研究，包括抗腫瘤，免疫調節，抑菌作用等。重樓皂苷為螺旋甾烷類皂苷；皂苷由苷元與糖、糖醛酸或其他有機酸組成。其結構上包含一個共有的母核(圖1)，母核由六個環，27個碳原子組成，其中A、B、C、D為甾體母核(環戊烷多氫菲)。甾體母核連接一個呋喃環E和一個吡喃環F。并多以螺縮酮形式相連。

圖1 重樓中三種活性成分及其母核結構式

有研究報道重樓對亞洲A型流感病毒有抑制作用[11]。但目前國內外對研究仍主要集中于其抗腫瘤及免疫調節作用[12]，較少見其抗病毒方面的作用。為了研究重樓是否具有抗SARS-CoV-2的潛在作用，我們對3種主要重樓皂苷進行分子對接模擬，預測其結合ACE2的能力。通過結合自由能評估3種化合物與ACE2之間的相互作用，為COVID-19的藥物發現提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料

三種化合物結構見圖1。SARS-CoV-S/ACE2復合蛋白的三維結構在蛋白質數據庫(Protein Data Bank)中PDB的編號為6ACG。

1.2 方法

分子對接：所有的對接實驗運用Autodock 4.2程序。在AutoDock 4.2計算程序中，采用0.375間隔的70×70×70點陣模塊。使用Lamarckian遺傳算法進行對接計算，算法如下：150的群體，最大值2 500萬次能源評估，最高次數2 000，交叉率0.8，突變率0.02，獨立對接運行50次。使用公差為2的均方根偏差將對接構象聚類，并根據結合自由能評估最終對接結構。

2 結果

2.1 重樓皂苷I與SARS-CoV-2受體ACE2存在結合作用

分子對接結果表明，重樓皂苷I可能與ACE2酶具有最高的結合活性，結合自由能為-9.01 kcal/mol，潛在的結合位點包括Phe-40、Arg-273、Phe-274、Pro-346、Thr-347、Ala-348、Asp-350、Phe-390、Arg-393、Asn-394、His-401、Glu-402、Glu-406、Tyr-515、Arg-518等氨基酸殘基。重樓皂苷I的氫原子能夠與Glu-406上的氧原子形成氫鍵，氫鍵鍵長為2.2?(圖2)。

圖2 重樓皂苷I結合SARS-CoV-2受體ACE2的分子對接結果

2.2 重樓皂苷VI與SARS-CoV-2受體ACE2存在結合作用

重樓皂苷VI結合ACE2的自由能是-8.52 kcal/mol，潛在的結合位點包括Leu-73、Ala-99、Gln-102、Pro-346、Thr-347、Ala-348、Asp-350、Glu-375、His-378、Asp-382、Tyr-385、Asn-394、Gly-395、Asn-397、Glu-398、His-401、Glu-402、Arg-514等氨基酸殘基。重樓皂苷VI的氫原子能夠與Tyr-385氨基酸上的氧原子形成氫鍵，氫鍵鍵長為2.1?和2.2?；配體上的氫原子與Glu-402上的氧原子形成氫鍵，鍵長為2.0?(圖3)。

圖3 重樓皂苷VI結合SARS-CoV-2受體ACE2的分子對接結果

2.3 重樓皂苷VII與SARS-CoV-2受體ACE2存在結合作用

重樓皂苷VII結合ACE2的自由能是-8.21 kcal/mol，潛在的結合位點包括Phe-40、Ser-44、Trp-69、Leu-73、Pro-346、Thr-347、Ala-348、Trp-349、Asp-350、Glu-375、His-378、Phe-390、Asn-394、His-401、Glu-402、Glu-406、Tyr-515等氨基酸殘基。重樓皂苷VII的氫原子能夠與Ser-44上的氧原子形成氫鍵，氫鍵鍵長為2.0?(圖4)。

圖4 重樓皂苷VII結合SARS-CoV-2受體ACE2的分子對接結果

3 討論

以上對接結果表明，3個甾體皂苷和ACE2均存在較強的結合作用，而其中重樓皂苷 I和ACE2結合所需的能量最低。能量越低表明更易于結合ACE2。通過結合位點匯總分析，三種化合物共同結合ACE2蛋白的殘基有7個，分別是Pro-346、Thr-347、Ala-348、Asp-350、Asn-394、His-401、和Glu-402(圖5)。同時，從圖中可以看出重樓皂苷I和重樓皂苷VI結合活性位點取向相同，但是由于空間位阻原因，重樓皂苷VI無法像重樓皂苷I呈直線排布。重樓皂苷I和重樓皂苷VII的空間位阻類似，但是取向相反。三種藥物結合活性位點的結構主要是母核起著關鍵作用，與其相作用的氨基酸位點大部分以疏水作用氨基酸(His、Ala、Pro)為主，其次是起到氫鍵作用的氨基酸。含有羥基的氨基酸(Glu、Thr、Asp等)可以更好的容納糖環。

圖5 三種重樓皂苷結合SARS-CoV-2受體ACE2的分子對接總圖及共同結合的氨基酸殘基位點

由于SARS-CoV-2是一種新發現的病毒，目前還沒有確定或可用的特效藥物。而經濟有效的治療策略是利用現有藥物。臨床治療表明，中藥結合西藥對COVID-19具有顯著的治療效果[6]。因而篩選從中草藥中提取的現有藥物不失是一項有效策略。已有研究發現氯喹(chloroquine)在體外控制SARS-CoV-2感染方面非常有效。氯喹是一種4-氨基喹啉，除了主要作為抗瘧藥物，還能夠通過減少ACE2受體的末端糖基化，干擾SARS-CoV-2與ACE2受體結合來發揮抑制病毒復制的作用[13]。Cheng等[14]使用分子對接來計算氯喹與ACE2結合能。結果發現氯喹具有與ACE2的潛在結合能力，結合自由能為-5.70 kcal/mol，結合位點為Leu-95、Gln-58、Gln-102。與氯喹相比，三種重樓皂苷與ACE2的對接結合自由能更低。近期，隨著SARS-CoV-2感染的全球化擴散，越來越多的研究者投入到抗SARS-CoV-2藥物的篩選中。Yan等[15]通過分子對接對38種中國專利藥物進行針對ACE(PDB:1R4L)及病毒主要M蛋白酶(PDB: 6LU7)的對接篩選，發現了包括青蒿素、蘆丁、甘草甜素、葛根素、穿心蓮內酯、苦參堿等10種潛在抗SARS-CoV-2藥物。Liu等[16]基于網絡藥理學和分子對接研究發現木犀草素(-26.78 kJ/mol)、槲皮素(-26.36 kJ/mol)、去甲脫水淫羊藿黃素(-25.94 kJ/mol)與SARS-CoV-2 3CL水解酶存在結合作用?？赡苡行┧幬锱cACE2對接活性較低，但這并不意味著它們不適用COVID-19治療，因為對接模擬僅是提供一個前期研究的參考。此外，制定中藥處方的原則包括消除病原入侵和增強機體抵抗力。因此，我們不能排除有些藥物通過調節免疫系統對COVID-19起作用。有必要進行進一步的實驗，以驗證這些甾體皂苷類化合物是否可以靶向ACE2并預防細胞培養模型和實驗動物中SARS-CoV-2的感染。