miR-21介導PTEN/SMAD7信號傳導通路調控糖尿病腎病大鼠腎纖維化作用研究

朱戈麗，伍 軍，張艷霞，封寶紅，畢智敏，鞏雪敏，李 靜

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病較嚴重的一種并發癥，是慢性腎衰竭患者行血液透析或腎臟移植的首要因素[1]。DN典型的病理改變為腎小球、腎小管上皮細胞增大，細胞外基質增多，晚期進展為腎小球硬化[2]。但DN的具體發病機制尚未研究清楚，大部分學者認為與代謝紊亂、氧化應激、炎性反應等有關[3]。近年發現microRNA在個體發育、組織分化、細胞增殖與凋亡等多個過程中起重要的調控作用[4]。研究表明，多種microRNA在腎臟中均有表達，且與腎臟疾病的發生發展密切相關[5]。大量研究證實miR-21可能是DN的潛在分子靶點[6-7]。PTEN/SMAD7是miR-21下游重要的靶蛋白，但國內基于miR-21介導PTEN/SMAD7信號傳導通路調控DN的相關研究較少，故本研究通過建立DN大鼠模型，分析miR-21介導PTEN/SMAD7信號傳導通路在DN大鼠腎纖維化中的作用及其機制，為臨床DN的診斷與防治提供依據。

1 材料與方法

1.1病例選取 收集2018年6月—2019年3月武漢市第三醫院就診的DN患者45例和體檢健康者30例的血清樣本，納入標準：DN患者符合DN診斷標準[8]；體檢健康者各項實驗室生化指標均正常；年齡>18歲。排除標準：合并心、腦血管疾病；合并糖尿病酮癥酸中毒者；合并惡性腫瘤、自身免疫功能障礙等慢性疾病者；存在影響血miR-21水平因素者。DN患者中男26例，女19例；年齡53～76(62.39±9.85)歲。體檢健康者中男18例，女12例；年齡55～78(63.72±8.79)歲。

1.2實驗動物 實驗動物為浙江中醫藥大學動物實驗研究中心提供[動物許可證號：SCXK(浙)2019-0004]的雄性SPF級SD大鼠48只，6～8周齡，體質量180～220 g，適應性喂養1周后用于實驗。

1.3試劑與儀器 高糖高脂飼料購自北京博泰宏達生物技術有限公司，鏈脲佐菌素(STZ)購自上海源葉生物科技有限公司，慢病毒載體、miR-21慢病毒、引物序列購自北京華夏遠洋科技有限公司，miRNA逆轉錄試劑盒購自美國GeneCopoeia公司，SYBR Green qPCR Master Mix購自德國Merck millipore公司，BCA試劑盒購自美國Sigma公司，蛋白一抗購自美國Abcam公司。逆轉錄定量聚合酶鏈式反應儀購自美國Thermo Fisher公司，全自動生化分析儀購自中翰盛泰生物技術股份有限公司。

1.4研究方法

1.4.1動物分組、建模及處理：48只雄性SD大鼠隨機分為空白對照組(Blank組)、DN組、空載慢病毒組(Empty vector組)和沉默miR-21組(miR-21-shRNA組)，每組12只。Blank組給予正常飼料，其他組大鼠給予高糖高脂飼料喂養6周后，尾靜脈注射30 mg/kg STZ構建DN大鼠模型，72 h后檢測大鼠血糖，若血糖≥16.7 mmol/L提示DN動物模型構建成功[9]，均造模成功。造模成功后第1、5、9周Empty vector組和miR-21-shRNA組分別尾靜脈注射空載慢病毒液和miR-21慢病毒液，感染復數均為100；Blank組和DN組以等量0.9%氯化鈉注射液替代。于建模成功后第12周采用頸椎脫臼法處死各組大鼠，收集大鼠尾動脈血液3 ml和雙側腎臟組織。

1.4.2實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測DN患者和體檢健康者血清和大鼠腎組織中miR-21的表達：血液樣本進行抗凝處理后，小心分離淋巴細胞，加入TRIzol裂解液；取各組大鼠適量腎臟組織，加入TRIzol裂解液，以氯仿-異丙醇體系提取樣品總RNA，經微量核酸儀檢測其純度和濃度，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性；參照miRNA逆轉錄試劑盒說明書進行操作，合成cDNA模板；混入SYBR Green qPCR Master Mix進行qRT-PCR檢測。miR-21的上游引物為5'-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA-3'，下游引物為5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；內參基因U6上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。參數設置：95℃ 30 s，95℃ 10 s,60℃ 34 s，72℃ 1 min，共40個循環。采用2-△△CT法計算樣品中miR-21相對表達量。

1.4.3腎功能指標檢測：將大鼠血液以2000 r/min離心10 min，分離上層血清，應用全自動生化分析儀檢測大鼠血清肌酐(SCr)、尿素(BUN)含量。

1.4.4腎組織病理變化觀察：將各組大鼠腎臟組織制成石蠟組織切片行常規HE染色和Masson染色，光鏡下觀察腎臟病理組織變化和纖維化程度。

1.4.5Western blot法檢測大鼠腎組織中相關蛋白的表達：采用放射免疫沉淀分析裂解液提取腎組織粉末中總蛋白，經BCA試劑盒測定蛋白濃度；取適量蛋白樣品，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉移至硝酸纖維素膜上；再浸于5%脫脂奶粉中封閉，37℃下孵育1 h；加入I型膠原(Col I)、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)及SMAD7蛋白一抗，4℃下孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃孵育30 min；經化學發光后觀察蛋白條帶，利用Image J軟件進行灰度分析，以β-actin為內參，計算Col I、MMP-2、TGF-β1、PTEN及SMAD7蛋白相對表達量。

2 結果

2.1DN患者和體檢健康者血清miR-21水平比較 體檢健康者血清中miR-21表達量為1.06±0.13，DN患者miR-21表達量為2.67±0.32，DN患者血清miR-21水平明顯高于體檢健康者(t=26.111，P<0.001)。見圖1。

圖1 DN患者和體檢健康者血清miR-21水平比較 DN為糖尿病腎病；與健康者比較，bP<0.01

2.2沉默miR-21對各組大鼠腎組織中miR-21水平影響 與Blank組比較，DN組、Empty vector組及miR-21-shRNA組腎組織中miR-21水平明顯升高(P<0.01)；與DN組比較，miR-21-shRNA組miR-21水平明顯降低(P<0.01)，但Empty vector組miR-21水平無明顯變化(P>0.05)；與Empty vector組比較，miR-21-shRNA組miR-21水平明顯降低(P<0.01)，見表1。

表1 沉默miR-21對各組大鼠腎組織miR-21的影響

2.3沉默miR-21對各組大鼠腎功能指標的影響 與Blank組相比，DN組、Empty vector組及miR-21-shRNA組SCr水平明顯升高(P<0.05)，DN組和Empty vector組BUN水平明顯升高(P<0.01)；與DN組相比，miR-21-shRNA組SCr、BUN水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，但Empty vector組上述指標水平無明顯改變(P>0.05)；與Empty vector組比較，miR-21-shRNA組SCr、BUN水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，見表2。

表2 沉默miR-21對各組大鼠腎功能指標的影響

2.4沉默miR-21對各組大鼠腎組織病理變化的影響 HE染色顯示，Blank組腎組織中腎小球、間質結構正常，系膜細胞數量和基質分布無明顯改變；DN組腎小球明顯增大，系膜細胞增殖明顯，間質增多，腎小管上皮細胞伴有壞死、萎縮；與DN組比較，miR-21-shRNA組上述病理改變明顯減輕，但Empty vector組與DN組無明顯差異。Masson染色顯示，Blank組腎小球、腎小管及間質結構均發生異常變化；DN組腎小球基質中膠原纖維顯著增加，纖維組織增多；與DN組相比，miR-21-shRNA組纖維化程度減輕，但Empty vector組無明顯變化。見圖2。

圖2 沉默miR-21對各組大鼠腎組織病理變化的影響(×400) Blank組為空白對照組，DN組為糖尿病腎病組，Empty vector組為空載慢病毒組，miR-21-shRNA組為沉默miR-21組

2.5沉默miR-21對各組大鼠腎組織中相關蛋白表達的影響 與Blank組相比，DN組、Empty vector組及miR-21-shRNA組腎組織中Col I、MMP-2及TGF-β1表達明顯上調(P<0.01)，PTEN和SMAD7表達明顯下調(P<0.01)；與DN組相比，miR-21-shRNA組Col I、MMP-2及TGF-β1表達明顯下調(P<0.01)，PTEN和SMAD7表達明顯上調(P<0.01)，但Empty vector組Col I、MMP-2、TGF-β1、PTEN和SMAD7表達無明顯變化(P>0.05)；與Empty vector組比較，miR-21-shRNA組Col I、MMP-2及TGF-β1表達明顯下調(P<0.05)，PTEN和SMAD7表達明顯上調(P<0.05)，見表3。

表3 沉默miR-21對各組大鼠腎組織中相關蛋白表達的影響

3 討論

miRNA是體內高度保守、非編碼的小RNA分子，廣泛分布于各種組織和細胞中，但存在差異性表達[10]。數據表明，miRNA在DN中發揮著重要的調節作用[11]。本研究采用qRT-PCR檢測DN患者和體檢健康者血清中miR-21的表達，結果顯示miR-21在DN患者中的表達明顯高于體檢健康者，提示miR-21可能參與DN的發病過程，與McClelland等[12]研究結果一致。但miR-21在DN中的具體作用機制還需進一步研究。

近年來，miR-21調控作用研究已在各領域中展開。腫瘤方面研究發現，miR-21是一種潛在的促癌基因，與腎癌、胃癌、肺癌等多種癌癥密切相關，且相關機制研究較多[13]。心血管系統方面研究發現，miR-21可能通過調控血管內皮細胞功能，參與心血管疾病的發生發展[14]。Wang等[15]研究顯示，miR-21在DN中過表達，可介導TGF-β1加劇腎損傷。本研究通過高糖高脂飼料結合STZ誘導DN大鼠模型，驗證了miR-21在DN中的作用。同時，抑制miR-21的表達可顯著改善DN大鼠腎組織病理損傷，降低血清SCr、BUN水平，進一步說明miR-21可能參與了DN的發展過程。

Bao等[16]研究顯示，miR-21通過作用于下游靶基因，來減少細胞外基質降解、促進腎臟間質肥大和系膜基質沉積，加劇腎臟組織纖維化，但國內尚缺乏相關報道。PTEN基因是蛋白激酶(AKT)的負性調節器，通過將磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸的第3位脫磷酸轉變為4,5-二磷酸磷脂酰肌醇，從而抑制AKT活性，阻斷PI3K/AKT信號傳導通路，而參與多種生命活動過程。Sekar等[17]觀察到OVE26 Ⅰ型糖尿病小鼠的系膜細胞中miR-21異常高表達，隨著病程的遷延，其腎臟組織中miR-21表達也逐漸升高；同時，高表達的miR-21會抑制PTEN的表達，敲低miR-21表達后PTEN表達增加，說明高血糖可引起腎臟組織中miR-21表達的增加，抑制 PTEN 蛋白表達可加劇腎纖維化。另外，細胞外基質沉積也是DN重要的病理表現之一。Lin等[18]研究發現，miR-21可能經介導SMAD7調節腎損傷，敲除miR-21恢復腎組織中SMAD7水平，并抑制TGF-β1和核轉錄因子活化，從而改善腎纖維化程度。本研究顯示，DN大鼠腎組織出現明顯的纖維化，且Col I、MMP-2及TGF-β1的表達明顯上調，PTEN和SMAD7的表達明顯下調；而沉默miR-21后，腎纖維化程度降低，Col I、MMP-2及TGF-β1的表達顯著下調，PTEN和SMAD7的表達明顯上調，提示miR-21可能通過抑制PTEN/SMAD7信號傳導通路，上調纖維化相關蛋白的表達，促進細胞外基質的沉積，引起DN大鼠腎纖維化，與上述研究結果相符。

綜上所述，干擾miR-21的表達可作為治療DN的潛在策略，其可能通過PTEN/SMAD7信號傳導通路逆轉腎組織纖維化，但DN不同階段與miR-21的關系還需大量臨床研究驗證。