葉黃素通過激活Nrf2信號傳導通路抑制糖尿病性骨質疏松模型大鼠氧化應激及炎性反應的機制研究

張衛華，陳 東

糖尿病性骨質疏松癥(diabetic osteoporosis，DOP)作為糖尿病引起的一種繼發性骨質疏松，會出現不同程度的骨密度降低[1-2]。相關研究結果表明，1型糖尿病患者骨折的發生率是非糖尿病人群的6.3～6.9倍[3]，而骨折后的致殘率及病死率極高，極大影響患者生活質量。葉黃素作為一種有效的抗氧化劑，能夠有效緩解游離自由基對人體細胞及器官的過氧化損傷，現代藥理研究發現其具有保護視覺、預防動脈硬化、抗氧化、抗癌等作用[4]。相關研究顯示氧化應激及炎性反應在DOP發生進展中扮演著重要角色[5-6]。故本研究旨在通過建立糖尿病并卵巢切除骨質疏松模型，后用葉黃素進行干預，分析其對DOP的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雌性8周齡SD大鼠30只，體質量250～280 g，購于廣東省醫學實驗動物中心[實驗動物許可證號：SCXK(粵)2019-0035]，常規飼養、全天自由飲水，培育室溫度20～25℃，濕度65%～70%，進行人工光照(晝夜各12 h)。

1.2主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ)購自Solarbio公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司；兔抗大鼠核因子E2相關因子(Nrf2)、血紅素氧合酶-1(HO-1)、醌氧化還原酶1(NQO1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體購自上海谷研實業有限公司。

1.3實驗動物分組及模型制備 30只雌性SD大鼠，隨機分為假手術組、模型組、干預組各10只。模型組及干預組大鼠進行糖尿病造模前12 h禁食不禁飲，采取腹腔單次注射STZ 60 mg/kg，假手術組給予等體積檸檬酸緩沖液腹腔注射，注射后正常飲水飲食。注射72 h后檢測大鼠空腹血糖，>16.7 mmol/L認為造模成功。將造模成功后的模型組及干預組大鼠用10%水合氯醛麻醉后，保持仰臥位固定在手術臺上，于腹部正中線切3 cm長的縱向切口，使皮膚切口偏向另一側后，分離髂棘上1.5 cm處的肌肉，以眼科彎鉗深入切口，找到一側卵巢，用手術線結扎輸卵管后切除并止血，采取同樣方式切除另一側卵巢，完成后間斷縫合肌肉及皮膚，并在切口處滴青霉素抗炎。假手術組大鼠同樣方式找到卵巢，切除卵巢附近小塊脂肪，其余步驟一致。以股骨骨密度及血清雌二醇降低視為DOP造模成功[7]。

1.4藥物干預 手術完成后1周，干預組大鼠給予200 mg/kg葉黃素灌胃干預，每日1次，假手術組及模型組大鼠給予等量0.9%氯化鈉注射液每日1次灌胃。藥物干預8周。

1.5樣本采集 末次給藥1 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，仰臥位固定在XR-36雙能X線骨密度測量儀(亞光醫用電子技術研究所生產)上，檢測后肢股骨密度，取下腔靜脈血1500 r/min離心15 min后，取上清存于-20℃條件下待測。斷頭處死大鼠，分離右側股骨，一部分以10%甲醛固定并加入10%乙二胺四乙酸二鈉脫鈣后用于組織切片觀察，另一部分于液氮中速凍轉存至-80℃待測。

1.6股骨組織HE染色 取“1.5”中固定、脫鈣后的股骨組織進行常規脫水、透蠟、包埋、切片后，蘇木素伊紅染色，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察染色情況并拍照。利用BI 2000醫學圖像分析系統進行成骨細胞及破骨細胞計數。

1.7血清鈣水平及炎癥因子檢測 取“1.5”中制備好的血清，采用全自動生化分析儀測定血清鈣水平。應用酶標儀測定樣本在450 nm處的吸光度(OD)值，并以固定濃度標準品為橫坐標，相應OD值為縱坐標畫出標準曲線，并根據檢測樣品測得的OD值計算相應的TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.8股骨組織中氧化應激指標檢測 取“1.5”中分離的股骨在液氮環境下研磨成粉末狀，稱取50 mg樣本加入450 μl磷酸緩沖鹽溶液后混勻，根據酶聯免疫吸附法試劑盒說明書操作步驟測定SOD、MDA、ROS水平，計算方式同“1.7”。

1.9Western blot法檢測股骨組織中Nrf2、HO-1、NQO1水平 取“1.5”中分離的股骨在液氮環境下研磨成粉末狀，稱取50 mg樣本加入450 μl磷酸緩沖鹽溶液后混勻，經高速低溫離心去沉淀，進行BCA蛋白定量、高溫蛋白變性，通過Bradford法調整各組蛋白濃度一致。經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳、電轉膜至甲醛預處理的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，密封2 h，加入兔抗大鼠Nrf2、HO-1、NQO1、GAPDH抗體(1︰1000)一抗4℃孵育過夜，TBST漂洗40 min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1︰500)孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL發光液將PVDF膜顯色，暗室曝光到X線片上，采用Imaging System軟件分析各組條帶灰度值，以目標蛋白與內參積分OD比值表示蛋白相對表達水平。

2 結果

2.1葉黃素對各組大鼠病理變化的影響 HE染色結果顯示：假手術組股骨組織中可見骨小梁排列整齊，間充質細胞數量較少，未見破骨細胞；模型組骨小梁排列紊亂，可見大量間充質細胞和紅細胞，并且破骨細胞數量顯著增加，成骨細胞數量顯著減少；干預組有新生骨小梁形成，破骨數量顯著減少，成骨細胞數量顯著增多。見圖1。

與假手術組相比，模型組骨密度、血清鈣、成骨細胞數降低，而破骨細胞數升高，差異有統計學意義(P<0.05)；干預組與假手術組相比，骨密度、血清鈣降低，破骨細胞數升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，干預組骨密度、血清鈣、成骨細胞數升高，而破骨細胞數降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同方法處理的SD大鼠骨密度、血清鈣水平及成骨細胞、破骨細胞計數比較

2.2葉黃素對各組大鼠股骨組織中氧化應激指標的影響 與假手術組相比，模型組和干預組股骨組織中MDA含量及ROS熒光強度升高，SOD活性降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，干預組股骨組織中MDA含量及ROS熒光強度降低，SOD活性升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同方法處理的SD大鼠股骨組織SOD、MDA、ROS水平比較

2.3葉黃素對各組大鼠血清炎癥因子水平的影響 與假手術組相比，模型組和干預組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均升高(P<0.05)；與模型組相比，干預組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 不同方法處理的SD大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6比較

2.4葉黃素對各組大鼠股骨組織中Nrf2、HO-1、NQO1表達的影響 Western blot結果顯示：與假手術組相比，模型組和干預組股骨組織中Nrf2、HO-1、NQO1表達水平降低(P<0.05)；與模型組相比，干預組股骨組織中Nrf2、HO-1、NQO1表達水平升高(P<0.05)。見圖2及表4。

表4 不同方法處理的SD大鼠股骨組織Nrf2、HO-1、NQO1表達

3 討論

隨著人民生活水平的提高及老齡化程度的加重，糖尿病發病率呈逐年上升趨勢，已成為腫瘤及心腦血管疾病后的第三大慢性非傳染性疾病[8]。STZ是誘發糖尿病模型的常用藥劑，相關研究發現，SD大鼠腹腔注射STZ 60 mg/kg 21 d后可顯著觀察到骨骺端堿性磷酸酶活性及鈣離子含量降低[9]。本研究通過STZ注射和卵巢切除誘導DOP模型，結果顯示大鼠骨密度、血清鈣、成骨細胞數顯著降低，而破骨細胞數顯著升高，表明造模成功。

研究表明，氧化應激是DOP重要發病機制之一。正常生理情況下，機體內ROS的產生及清除會處于一種動態平衡，故破骨細胞產生的適量自由基能發揮促進骨組織改建作用[10]。胰島素缺乏后會抑制抗氧化酶活性，清除ROS能力降低，破骨細胞產生的自由基產物無法清除，過量的氧自由基會產生一系列氧化損傷，抑制大部分細胞的分化、生長及增殖過程[11]。本研究顯示，與假手術組相比，模型組大鼠股骨組織中SOD活性顯著降低，MDA含量及ROS熒光強度顯著升高；與模型組相比，干預組股骨組織中MDA含量及ROS熒光強度降低，SOD活性升高。表明DOP大鼠體內氧化應激反應較為嚴重，而葉黃素干預后，SOD活性顯著升高，MDA及ROS顯著降低，可能是因葉黃素本身就是一種有效的自由基清除劑，能通過與ROS作用，降低ROS水平，減輕其對SOD活性的抑制作用，同時減少過量ROS對脂膜的攻擊，從而降低MDA。Nrf2是一種重要的抗氧化蛋白，當機體產生氧化應激反應時，Nrf2能迅速磷酸化激活并轉移至細胞核中，通過作用下游ARE蛋白，促進HO-1、SOD、NQO1等的表達[12]。HO-1作為Nrf2的下游靶蛋白具有多種作用，高表達HO-1可以顯著減輕組織損傷[13]；NQO1則是一類黃素蛋白酶，通過催化胞內雙電子還原反應，進而解除醌類物質對細胞的毒害，從而發揮細胞和器官保護作用[14]。本研究結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠股骨組織中Nrf2、HO-1、NQO1表達水平均顯著降低，葉黃素干預后Nrf2、HO-1、NQO1表達水平均顯著升高，表明葉黃素可能是通過激活Nrf2信號傳導途徑，誘導抗氧化蛋白表達，從而改善DOP大鼠的氧化應激反應來保護骨組織。

炎性反應也是DOP的重要發病機制，氧化應激反應發生的同時會促進TNF-α、IL-1β等促炎因子合成，同時也會激活NF-κB信號傳導途徑促進骨形成蛋白及IL-6等促炎因子表達，并利于破骨細胞增殖、分化及生長，加速骨吸收，促進DOP進展[15]。本研究結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6均顯著升高，而葉黃素干預后TNF-α、IL-1β、IL-6均下降，可能原因為葉黃素改善了DOP大鼠體內炎性反應程度，降低自由基水平，減少了對炎性反應信號傳導通路的刺激。

綜上，葉黃素可能通過激活Nrf2信號傳導通路，促進抗氧化酶合成分泌，減輕DOP大鼠的氧化應激反應及炎性反應程度，從而緩解骨質疏松。