酉陽縣一起感染性腹瀉的病原學檢驗及結果分析

田維鋒

[摘要]：目的通過一起腹瀉事件的調查處理和實驗室檢驗，迅速，準確檢出病原體，為疫情處理提供科學依據。方法病人肛拭，剩余食品按照GB4789增菌，分離，通過形態(tài)，生化，血清學實驗，噬菌體，PCR結合進行鑒定;藥敏實驗采用K一B法，生活飲用水采用GB/T5750.12-2006檢驗。結果病人肛拭23件，其中3，9，12，16號檢出EIEC;生活飲用水6件總大腸菌群，耐熱大腸菌群，大腸埃希氏菌均>1600MPN/100ml，未檢出EIEC及其它致病菌;剩余食品9件未檢出EIEC及其它致病菌。結論經流行病學調查，臨床癥狀，實驗室檢驗結果，確認為是一起由腸道侵襲性大腸埃希氏菌（以下簡稱EIEC）引起的感染性腹瀉事件。

[中圖分類號]R941.3 [文獻標識碼]A [文章編號]2107-2306（2020）04-297-02

2019-4-30，酉陽縣疾控中心接到轄區(qū)一醫(yī)院報告，該院陸續(xù)收到一批發(fā)熱，惡心，嘔吐，腹痛，腹瀉的病人，我中心立即前往現場，開展流行病學調查，采樣，實驗室檢驗。后經流行病學調查，臨床癥狀，實驗室檢驗結果，確認為是一起由腸道侵襲性大腸埃希氏菌引起的感染性腹瀉事件，本文僅從病原菌檢驗部分分析與同行交流。

1樣品名稱

病人肛拭23件，生活飲用水6件，剩余食品9件。

2檢驗依據

GB4789[1-8]，《霍亂防治手冊》第六版[9]，GB/T5750.12-2006[10]

3檢驗項目

沙門氏菌，志賀氏菌，金黃色葡萄球菌，霍亂弧菌，致瀉性大腸埃希氏菌，副溶血性弧菌，單核細胞增生李斯特氏菌，蠟樣芽胞桿菌。

4檢驗儀器及試劑

沙門氏菌，李斯特氏菌，0157顯色平板，弧菌顯色平板，金黃色葡萄球菌顯色平板來自鄭州博賽公司，生產批號20181112;其它成品培養(yǎng)基均來自青島海博技術有限公司，在有效期內使用;沙門氏菌屬診斷血清，志賀氏菌屬診斷血清，霍亂弧菌抗體A，B，C，霍亂弧菌0139群診斷血清生產批號20190101EPEC，EIEC，ETEC，0157診斷血清，生產批號20181201均來自寧波天潤公司;五種致瀉大腸埃希氏菌PCR試劑來自北京卓誠公司，生產批號20190301。腸桿菌科噬菌體（7滴法），大腸埃希氏菌分型噬菌體來自金羿噬菌體公司，生產批號20190108;VITEK2來自生物梅里埃公司，PCR儀型號AFD9600，生產廠家達安公司。

5檢驗步驟

5.1取各樣品半固體直接劃線分離于SS，DHL，沙門氏菌顯色平板，Mac，EMB，SMAC，0157顯色平板，PALCAM，李斯特顯色平板，MYP，4號瓊脂，TCBS，弧菌顯色平板，血平板，經適宜條件培養(yǎng)后觀察結果。生活飲用水檢測總大腸菌群，耐熱大腸菌群，大腸埃希氏菌且做上述致病菌檢測。

5.2分別取各樣品半固體Iml，加入到10mlBPW，TTB，SC，志賀菌增菌肉湯，7.5%氯化鈉肉湯，APW，LB1，EC，改良EC肉湯，胰酪胨大豆多粘菌素肉湯。經適宜條件培養(yǎng)后，分別轉種于上述分離平板，經適宜條件培養(yǎng)后，觀察結果。

5.3PCR取各樣品半固體Iml于10ml營養(yǎng)肉湯中，經37C6h后，取400微升按試劑說明書，進行操作。

5.4經觀察，在3，9，12，16號樣品在SS，DHL，Mac，EMB上有無色，半透明，中等大小的菌落生長;其余平板均未見可疑菌落生長。

5.5分別取上述可疑菌落進行純培養(yǎng)，用VITEK2進行生化鑒定、手工生化、血清學實驗、腸桿菌科噬菌體實驗、Sh噬菌體原液/IRTD及PCR實驗、大腸埃希氏菌分型噬菌體實驗，藥敏實驗;結果見表1-5。

5.63，9，12.16號菌株與EPEC.EIECETEC，O157診斷血清均未凝集。

5.73，9，12，16號菌株經上機鑒定為大腸埃希氏菌，且賴AA-，動力-，PCR鑒定為EIEC且檢出ipaH，CT值均小于30。

6檢驗結果

病人肛拭23件，其中3，9，12，16號檢出EIEC;生活飲用水6件總大腸菌群，耐熱大腸菌群，大腸埃希氏菌>1600MPN/100ml，未檢出EIEC及其它致病菌;剩余食品9件未檢出EIEC及其它致病菌。

討論

1致瀉性大腸埃希氏菌共分為5種即EPEC致病性大腸埃希氏菌，EIEC侵襲性，ETEC產腸毒素大腸埃希氏菌，EHEC出血性大腸埃希氏菌，EaggEC腸集聚性大腸埃希氏菌，統(tǒng)稱DEC。EPEC主要引起幼兒發(fā)病，發(fā)熱，粘液便，靠eae，bfp致病;EIEC引起類似痢疾癥狀，腹部劇痛，有粘液便，膿血便，靠ipaH致病;ETEC引起腹痛，腹瀉，引起旅游者，類似霍亂癥狀，靠腸毒素LT，ST致病;EHEC是引起出血性腸炎，痙攣性疼痛，鮮血樣糞便，依賴stxl，stx2致病;EaggEC引起腹痛腹瀉，靠eagg，astA致病。現在國內每年發(fā)生的食物中毒中，無論中毒次數還是發(fā)病人數均以微生物為主，微生物中又以細菌性食物中毒為主。細菌性食物中毒或感染性腹瀉中，致瀉性大腸埃希氏菌占有重要地位。對于DEC的檢測，國家標準現為生化反應+PCR，對于生化反應符合株檢測相應毒力基因來確診。筆者查閱多篇報道，發(fā)現幾乎所有食物中毒株均能進行血清學定型。本次事件由EIEC引起。侵襲性致瀉大腸埃希氏菌（EIEC）可通過污染的水和食物引起暴發(fā)或流行，也可因接觸傳播形成散發(fā)病例;成人、兒童均可發(fā)，臨床表現與菌痢相似，主要為腹痛、腹瀉、發(fā)熱、膿血便等"2;EIEC未定型，是否與診斷血清種類較少，涵蓋不夠有關，值得進一步商討;根據OAg，HAg.KAg來判定菌型更準確，尤其是OAg結合HAg會更準確。

2由于在EMB，Mac上，EIEC與志賀氏菌難以區(qū)分，均為無色，半透明，中等大小的菌落，區(qū)分二者可采用各種實驗如酒石酸鹽，醋酸鹽，粘液酸，葡萄糖銨等，但區(qū)分大腸埃希氏菌與志賀氏菌以葡萄糖銨最好，大腸埃希氏菌葡萄糖銨+，志賀氏菌葡萄糖銨一。實驗發(fā)現，4株菌株葡萄糖銨+見表1，經上機鑒定也為大腸埃希氏菌。我們在實驗中采用何曉青的腸桿菌科噬菌體效果很好，可以省去常規(guī)生化鑒定。我們發(fā)現4株菌裂解模式一致見表2，均出現Sh原液裂解，IRTD不裂解見表3。Sh類似于ipaH，它作用于細菌細胞壁受體，可使志賀氏菌及EIEC裂解。可以采用三步法進行篩選，葡萄糖銨+;賴AA-，動力-（除0124動力+外）;選取Sh原液裂解，1RTD不裂解的菌株結合檢出ipaH即可鑒定為EIEC。國家標準規(guī)定賴AA-，動力-（除0124動力+外），可以防止將普通大腸埃希氏菌誤診為EIEC。我們采用生化反應，噬菌體結果與PCR結果結合，可使結果更準確。