4種芳香植物精油對竹林病原真菌的抗菌性*

王安可 畢毓芳 溫 星 王玉魁 蔡函江

(國家林業和草原局竹子研究開發中心 竹子資源與利用國家林業和草原局重點實驗室 杭州 310012)

真菌病害大約占整個植物病害的70%～80%(邵淑君， 2016)，在植物病害中危害最重、影響最廣。竹林的真菌病害主要有毛竹枯梢病、基腐病、竹稈褐腐病、竹葉銹病、竹稈銹病、竹黑粉病、竹赤團子病、竹肉球病、竹黑痣病、竹叢枝病等。

芳香植物是具有香氣和可供提取芳香油[又稱植物精油(plant essential oil)]的栽培植物和野生植物的總稱。植物精油是植物體內的次生代謝物質，化學組成較為復雜。在醫學領域，植物精油在去痛、降壓、消炎、提高免疫力、抗菌和保健等方面得到了廣泛的應用。在病蟲害防治方面，植物精油具有對病原物和害蟲生物活性很高，又不易產生抗藥性，且對人畜毒性很小、不污染環境等優點，是一種很好的生物農藥原料。

目前已經發現許多對植物病原真菌有抑制作用的植物精油(Zuzarteetal.， 2012; Marongiuetal.， 2012),如:菊花(Chrysanthemumviscidehirtum)、斯里蘭卡肉桂(Cinnamomumzeylanicum)、大西洋雪松(Cedrusatlantica)、敘利亞蕓香(Rutachalepensis)、檸檬馬鞭草(Lippiacitriodora)和唇萼薄荷(Menthapulegium)精油對植物病原真菌指狀青霉菌(Penicilliumdigitatum)、柑橘褐腐疫霉(Phytophthoracitrophthora)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、柑橘酸腐病菌(Geotrichumcitriaurantii)有抑制作用(Bouchraetal.， 2003); 百里香(Thymusvulgaris)、薄荷(Menthapiperita)和亞香茅(Cymbopogonnardus)精油對鱷梨(Butyrospermumparkii)和桃(Amygdaluspersica)的病原菌膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobromae)、桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)、匍莖根霉菌(Rhizopusstolonifer)和擴展青霉菌(Penicilliumexpansum)均具有優良的抗菌力(Sellamuthuetal.， 2013)。此外，丁香蒲桃(Syzygiumaromaticum)、肉桂(Cinnamomumcassia)、天竺葵(Pelargoniumhortorum)、月桂(Laurusnobilis)、互葉白千層(Melaleucaalternifolia)、薄荷(Menthahaplocalyx)、八角(Illiciumverum)、柑橘(Citrusreticulata)和藿香薊(Ageratumconyzoides)等精油對十余種常見的農業病原菌都有抗菌活性(Kishoreetal.， 2007; Huangetal.， 2010; 吳建挺, 2013; 寧蕾等, 2012; Singhetal.， 2016)。

筆者研究了4種芳香植物精油對12種竹林病原真菌的抗菌能力，以期為利用植物精油防治竹林病害提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

互葉白千層(又名茶樹,tea tree)、香茅(Cymbopogonnardusvar.lenabatu)、肉桂和大蒜(Alliumsativum)精油均購自莉微兒(深圳)貿易有限公司。根據徐梅卿等(2006)關于中國竹類病害的記錄，選取中國林業微生物保藏管理中心(CFCC)已保藏的12種竹林病原真菌(表1)作為供試菌種，上述菌種均購自CFCC。天然化學提取物均購自百靈威科技股份有限公司。

表1 12種竹源致病真菌Tab.1 Twelve kinds of bamboo pathogenic fungi

1.2 方法

選用4種常見的芳香植物互葉白千層、香茅、肉桂和大蒜，并挑選出12種竹林病原真菌進行最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小殺真菌濃度(minimal fungicidal concentration，MFC)試驗。此外還對精油的主要化學組分松油烯-4-醇、香茅醛、香茅醇、香葉醇、反式肉桂醛、二烯丙基硫醚和二烯丙基二硫醚的抗菌性能進行測試。

1.2.1 植物精油化學組分檢測 委托蘇州禾川化學技術服務有限公司按照國家標準GB/T 11538—2006《精油 毛細管柱氣相色譜分析 通用法》對精油進行檢測，用面積歸一化法計算主要成分含量。

1.2.2 菌種懸浮液的制備 將12種真菌的菌絲體(初代菌絲體由CFCC提供)接種在含PDA培養基的90 mm培養皿中，溫度28 ℃、濕度80%±5%、暗培養7天。將培養基表面的菌絲轉移到已滅菌的研缽中，加少許無菌生理鹽水稍許研磨，后使用無菌棉球過濾，制備成懸濁液。使用血球計數板計數，根據結果將各菌懸浮液稀釋到終濃度為1×106個·mL-1，4 ℃保存備用。

1.2.3 精油的乳化處理 由于精油未經乳化無法融入培養基，所以在培養基中添加精油或化學組分之前需要使用3%聚乙烯醇對其進行乳化。在加入培養基之前，將其與3%聚乙烯醇1∶1進行混合，然后再將乳化后的精油或化學組分根據需要加入培養基混合。

1.2.4 MIC和MFC的確定 PDA培養基在高溫滅菌后50 ℃時根據試驗設計體積分數加入乳化后精油，混合均勻后趁熱倒入48孔板，冷卻2天后觀察無污染可接種使用，每孔接種菌種懸浮液2 μL，28 ℃暗培養。試驗設計體積分數為0.005%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.5%、2.0%。試驗時從低體積分數開始，當MIC和MFC出現后，不再測試更高體積分數，每個處理4個重復。MIC的判定標準為： 當CK開始生長時，所試體積分數中菌種未開始生長的最低體積分數為MIC； MFC的判定標準為： 所試體積分數中10天內菌種未生長的最低體積分數。

1.2.5 精油與內含化學成分抗菌能力的測定 選擇合適體積分數(在MIC和MFC之間)的精油和主要化學組分對12種菌進行抗菌比較試驗，每個處理重復3次。具體處理體積分數為： 肉桂0.01%(黑附球菌與竹針孢座囊菌采用肉桂0.02%)，大蒜0.05%，香茅0.1%(鏈格孢菌采用香茅0.03%)，互葉白千層0.1%(包括尖孢枝孢、鏈格孢、出芽短梗霉、黑附球菌與竹針孢座囊菌)和0.5%(其余7種菌)； 反式肉桂醛為肉桂精油的主要成分，體積分數與其相同，二烯丙基硫醚和二烯丙基二硫醚是大蒜精油的主要成分，體積分數與其相同，香茅醛、香茅醇和香葉醇是香茅精油的主要成分，香茅醛體積分數與其相同，香茅醇和香葉醇體積分數為香茅的25%，松油烯-4-醇是互葉白千層精油的主要成分，體積分數與其相同。

將100 μL菌種懸浮液接種到90 mm PDA培養皿中(推棒涂勻，盡量保證培養基每個角落的菌種數量一致)，溫度28 ℃、濕度80%±5%、暗培養7天。用7 mm打孔器將生長好的菌分割，分割好的菌塊在同一時間接種到配置好的含有不同體積分數精油和化學成分的培養皿中(培養基配置方法同1.2.4)，28 ℃暗培養。連續記錄菌體的生長直徑，直到菌體生長直徑大于8 cm或者生長時間超過12天時停止記錄。

2 結果與分析

2.1 精油的化學成分

2.1.1 互葉白千層精油的化學成分 本研究中使用的為松油烯-4-醇型白千層油，其組分和含量見表2。這些主要組分基本符合國際(ISO 4730: 2017)和國內標準(GB 1886.270—2016)。

表2 互葉白千層精油的化學成分Tab.2 Compositions of tea tree essential oil

市面上多數的白千層精油(又名茶樹精油)原料為互葉白千層，但包鱗白千層(M.bracteata)、白油樹(M.quinquenervia)、石南葉白千層(M.ericifolia)、綠花白千層(M.viridiflora)、白千層(M.leucadendron)、散花白千層(M.dissiliflora)和輪葉白千層(M.linariifolia)等也可以作為白千層油的原料(梁忠云等， 2012)。白千層精油根據主成分的不同可分為不同的化學類型(不依賴植物學分類)，如松油烯-4-醇型、γ-松油烯型和桉葉素型等(Homeretal.， 2000)； 這些類型的不同與引種地和栽培環境有密切的關系(陳海燕等， 2003)。

2.1.2 香茅精油的化學成分 香茅精油的主要成分和含量見表3，根據試驗結果，筆者認為本試驗所用精油更符合爪哇型，盡管采購時精油的標簽拉丁名是斯里蘭卡型。

表3 香茅精油的化學成分Tab.3 Compositions of citronella essential oil

目前市面上香茅精油主要分為2種： 爪哇型(Java type，Cymbopogonwinterianus)和斯里蘭卡型(Sri Lankan type，Cymbopogonnardusvar.lenabatu)。國際上對這2種不同的香茅精油也制定了相應的標準： 爪哇型ISO 3848：2016，斯里蘭卡型ISO 3849: 2003。這2種香茅精油在成分上有很大的區別，尤其是香茅醇和香茅醛的含量。爪哇型香茅中香茅醛的含量最少不能少于31%，但斯里蘭卡型香茅中香茅醛的含量最大為6%； 香茅醇的含量也是如此，爪哇型的最小值8.5%是斯里蘭卡型的最大值； 爪哇型香葉醇含量為20%～25%，斯里蘭卡型為15%～23%。

2.1.3 肉桂精油的成分分析 經檢測，本試驗用的肉桂精油中含有80.72%的反式肉桂醛，此外還檢測到13.9%的水楊酸甲酯，但該成分在各個標準(包括國標GB 1886.207—2016)中都沒有提及。

與香茅類似，主流的肉桂精油分為中國型(Chinese type,C.cassia)和斯里蘭卡型(Sri Lankan type,Cinnamomumzeylanicum)。國際上對應的精油標準分別為ISO 3216: 1997(Oil of cassia)和ISO 3524: 2003(Oil of cinnamon leaf)。2種精油在成分上并沒有較大的區別，主要成分都是反式肉桂醛，只是中國型規定反式肉桂醛的最高含量為88%，斯里蘭卡型為83%。

2.1.4 大蒜精油的化學成分 大蒜精油的化學成分及含量見表4。目前ISO并沒有針對大蒜精油的標準，只有對干燥蒜的標準。我國對大蒜油的標準(GB 1886.272—2016)中并未對關鍵成分進行說明和規定。

表4 大蒜精油的化學成分Tab.4 Compositions of garlic essential oil

本次的檢測結果與Zhao等(2013)對大蒜精油測定的結果(二烯丙基三硫醚50.43%、二烯丙基二硫醚25.30%和二烯丙基硫醚6.25%)類似。

由于精油是植物采摘后蒸餾而成，其主要成分的種類和數量與植物的品種、生長環境、采摘季節和蒸餾方式有密切的關系。所以也導致不同批次精油的成分一定的差異。作為研究用途時，須對每一批次的樣品進行成分鑒定分析，根據標準作出是否可用的判斷。經過分析，本試驗中所用的精油可以用于試驗。

2.2 4種芳香植物精油對12種致病真菌的抗菌力(MIC和MFC)

從表5可以看出，總體上12種致病真菌對4種精油的抑制敏感度(以MIC來判斷)從強到弱依次是肉桂、大蒜、香茅和互葉白千層。肉桂精油的MIC多為0.005%，只有對長蠕孢和竹針孢座囊菌的MIC為0.010%； 大蒜精油對7種菌的MIC為0.005%，對4種菌的MIC為0.010%，對暗色節菱孢的MIC較高為0.200%； 香茅精油的MIC為0.005%～0.03%； 互葉白千層精油的MIC為0.03%～0.2%。

表5 4種芳香植物精油對12種真菌的MIC和MFC①Tab.5 MIC and MFC of 4 essential oils on 12 fungi %

以MFC為依據，抗菌活性從強到弱依次為肉桂、香茅、互葉白千層和大蒜精油。肉桂精油除了對尖孢枝孢的MFC為0.1%外，對其他11種菌的MFC均在0.01%～0.04%； 香茅精油除了對鏈格孢的MFC為0.04%外，對其他11種菌的MFC均為0.2%～0.5%； 互葉白千層精油的MFC為0.2%～1.5%； 大蒜精油的MFC為0.1%～1.5%，但有2個菌的MFC超出試驗體積分數2.0%。

MFC/MIC的值在醫學上可以作為耐藥性的一個指標。本試驗中，肉桂和互葉白千層精油耐藥性較好，香茅精油次之，大蒜精油最差。肉桂精油對尖孢枝孢的MFC/MIC為20，對其余11種菌的MFC/MIC在1～8； 互葉白千層精油對長蠕孢的MFC/MIC為30，對尖孢枝孢的MFC/MIC為33，對腐皮鐮刀菌的MFC/MIC是50，對其余9種菌的MFC/MIC為4～8； 香茅精油的MFC/MIC為10～40； 大蒜精油的MFC/MIC比較分散，范圍在10～300之間。

綜上所述，對于供試的12種真菌，以菌對藥劑的敏感程度(MIC數據)為據，敏感度從強到弱依次是肉桂、大蒜、香茅和互葉白千層精油； 以致死劑量(MFC數據)為據，殺菌力從強到弱依次是肉桂、香茅、互葉白千層和大蒜； 以菌對藥劑的耐藥性(MFC/MIC數據)為據，優先次序是肉桂、互葉白千層、香茅和大蒜。整體上，肉桂精油的抗菌力最好； 其次是香茅，再次是互葉白千層，大蒜較差。

這一結果與李文茹等(2013)相關研究認為幾種精油抗真菌活性由強到弱依次是肉桂、大蒜、丁香、香茅和迷迭香(Rosmarinusofficinalis)的觀點類似。盡管Dimic等(2015)曾指出與檸檬(Citruslimon)和香菜(Coriandrumsatium)精油比，肉桂精油的抗菌力并不突出，但在Viollon等(1994)和本研究中肉桂精油的抗菌力表現突出，都強于其他供試精油。香茅精油曾被多位研究者指出具有良好的生物農藥潛力，如Chen等(2014)成功將香茅精油應用于防治櫻桃番茄(Lycopersiconesculentum)病原菌鏈格孢，不僅降低了發病率并且對果實沒有影響。Nagendra等(2010)證實0.015%的香茅精油可以完全抑制印度楝(Azadirachtaindica)病原菌擬莖點霉(Phomopsisazadirachtae)的生長，并且它的抗菌力強于檸檬草(Cymbopogoncitratus)、紫丁香(Syringaoblata)、柏木(Cupressusfunebris)和薄荷(Menthahaplocalyx)精油。

2.3 4種芳香植物精油主要化學成分的抗菌力

2.3.1 肉桂精油的有效抑菌成分 肉桂精油的主要成分是反式肉桂醛，其含量一般在80%左右。如圖1所示，反式肉桂醛抑菌能力要強于同體積分數的肉桂精油(在對絲核菌、鏈格孢菌和竹針孢座囊菌時，抑菌能力幾乎相同)，可以肯定反式肉桂醛是肉桂精油的有效抑菌成分。

圖1 4種精油及有效成分抗菌力比較Fig.1 Comparison of antimicrobial activity of 4 essential oils and their active components

Singh等(2007)也證實反式肉桂醛是肉桂皮精油的主要成分，并且與肉桂精油具有同樣的抗菌活性。Wang等(2005)發現反式肉桂醛高含量(76%和81%)的土肉桂(Cinnamomumosmophloeum)精油比低含量(8%)的肉桂油具有更高的抗菌力，從另一方面說明反式肉桂醛是抗菌的主要有效成分。

2.3.2 香茅精油的有效抑菌成分 香茅精油的主要成分是香茅醛、香葉醇和香茅醇，含量分別為45%、22%和15%。在初期預試驗時，0.01%的香葉醇和香茅醇均能非常強烈抑制這12種菌的生長，所以在正式試驗時，將這2種成分的體積分數降為香茅精油的25%(該體積分數更接近香茅精油中這2種成分的實際含量)。

試驗結果(圖1)表明，除了香茅醛對鐮刀菌和黑附球菌無效外，香茅醛、香葉醇和香茅醇對其他菌均有不同程度的抑制作用。并且，香茅精油與同體積分數的香茅醛和自身體積分數25%的香葉醇和香茅醇相比，抑菌效果最好(除尖孢鐮刀菌之外)。這說明香茅醛、香葉醇和香茅醇是香茅精油抑菌的有效成分，并且它的抑菌效果是3種成分協同作用的結果(但不排除其他微量成分也有抑菌貢獻)。

該結果與Saikia等(2001)的研究結果類似，他發現香茅醛、香茅醇和香葉醇對石膏樣小孢子菌(Microsporumgypseum)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、黑曲霉(Aspergillusniger)和申克孢子絲菌(Sporothrixschenckii)都有抗菌作用，并且與香茅油相比，香葉醇和香茅醇的抗菌力更強。但Nakahara 等(2003)研究發現，香茅醛和芳樟醇對3個曲霉屬(Aspergillus)真菌、3個散囊菌屬(Eurotium)和4個青霉菌屬(Penicillium)有明確的抗性； 香茅醇和香葉醇對上述菌種并沒有抑菌活性。

2.3.3 大蒜精油的有效抑菌成分 大蒜精油的主要化學成分是二烯丙基三硫醚、二烯丙基二硫醚和二烯丙基硫醚，在本試驗中它們的含量分別是60.27%、32.06%和7.67%。非常遺憾的是，由于二烯丙基三硫醚未采購到(價格昂貴，且均需進口訂購)，本試驗并未對其抗菌的有效性進行試驗。

在本試驗中與大蒜精油同體積分數的二烯丙基硫醚，對試驗中的9種菌沒有任何抑菌效果，對其他3種菌抑菌效果微弱； 二烯丙基二硫醚對試驗中的3種菌沒有任何抑菌效果，對其他9種菌有一定的抑菌作用，但抑菌力均不如同體積分數的大蒜精油。由此可見，二烯丙基二硫醚和二烯丙基硫醚雖具有一定的抗菌力，并不是大蒜精油中的主要抑菌成分。

Avato等(2000)發現當少量的二烯丙基二硫醚(1%)與大量的二烯丙基三硫醚(88%)結合對3種酵母菌的生長的抑制作用有協同作用，其抑菌作用強于二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚。Tsao等(2001)比較了大蒜精油、二烯丙基硫化物、二烯丙基二硫化物、二烯丙基三硫化物和二烯丙基四硫化物對40個野生型金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的MIC，結果發現抗菌力從強到弱是二烯丙基四硫化物、二烯丙基三硫化物、二烯丙基二硫化物、二烯丙基硫化物和大蒜精油。

綜上所述，二烯丙基硫化物都有一定的抗菌作用，硫化數越高抗菌性可能越強，并且它們之間的抗菌性可能有拮抗和協同作用。

2.3.4 互葉白千層精油的有效抑菌成分 互葉白千層精油的主要成分松油烯-4-醇在本試驗中含量為53%。松油烯-4-醇在對9種菌的試驗中抑菌效果明顯強于同體積分數的互葉白千層精油； 對絲核菌、鏈格孢菌和竹針孢座囊菌的試驗中，與同體積分數精油抑菌效果相似。

Terzi 等(2007)對互葉白千層精油及其主要組分松油烯-4-醇、γ-松油烯、1，8-桉葉素的抗菌性進行對比，發現這3種組分對黃金鐮刀菌(Fusariumculmorum)、麥類核腔菌(Pyrenophoragraminea)和禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)均有抑制作用，其中松油烯-4-醇型尤為突出。Mondello 等(2006)在對互葉白千層精油、松油烯-4-醇和1，8-桉葉素的抗菌(Candidaspp.)性比對時發現，松油烯-4-醇具有極強的抑菌功能，但1，8-桉葉素在所試體積分數(4%)內沒有發現有抑菌效果。由此，可以肯定的是松油烯-4-醇是互葉白千層精油抗菌的主要活性成分。

3 討論

本研究發現，肉桂、香茅和互葉白千層精油對12種供試竹林病原真菌的抗菌性能較好，大蒜精油殺菌活力和耐藥性都較差。肉桂是一種出油率高、較容易獲得的食用型精油原料，將其開發為生物農藥的安全性和可行性都較高。肉桂還是一種可以在竹林中進行套種的高大喬木，套種不僅可以促進竹林的生長和增加竹林的經濟效益，并且可能降低竹林的真菌病害。香茅精油在本研究中也表現出優良的抗菌能力，并且對宿主植物的影響較小，也被多位研究者(Sellamuthuetal.， 2013; 吳建挺, 2013)證實具有開發成生物農藥的潛質。互葉白千層精油的抗菌力與肉桂和香茅精油比較差，且經濟成本較高，一般用作高端殺菌劑，并不適宜開發成生物農藥。

雖然本研究確定了4種精油的有效抗菌成分，但是這些有效成分現在并不適合用作開發生物農藥。一是由于這些成分均為天然成分，目前只能通過生物提取，經濟成本非常高； 二是精油的抗菌能力并不是單純的由這些抗菌成分而表現的，精油內在各成分的協同和配比是精油發揮抗菌作用的關鍵。因此，精油比這些單一的化學物質更適合開發為生物農藥。

此外，本文只是初步研究，將精油制成生物農藥還需要進一步深入研究其使用方法和配比。例如，Suhr 等(2003)曾提出精油的抗菌力與使用方法有很大的關系，例如含酚類較多的精油(肉桂、丁香等)通過液體直接接觸使用時的抑菌效果要強于氣態蒸發，但含有檸檬醛等的精油氣態的抑菌效果要強。又如Giordani 等(2006)將兩性霉素B與肉桂精油聯合使用，以期開發毒性更小、藥效更強的藥品。

4 結論

本文選取12種竹林病原真菌，通過對肉桂、香茅、大蒜和互葉白千層精油及化學組分抗菌力的研究發現： 肉桂、香茅、互葉白千層和大蒜精油均可以不同程度地抑制供試竹林病原真菌的生長。其中，病原真菌對4種植物精油的敏感度從強到弱依次是肉桂、大蒜、香茅和互葉白千層； 4種植物精油對病原真菌的殺菌活力從強到弱依次是肉桂、香茅、互葉白千層和大蒜； 病原真菌對4種植物精油的耐藥性從低到高依次是肉桂、互葉白千層、香茅和大蒜。綜合以上結果，綜合評價4種精油的抗菌性能依次是肉桂、香茅、互葉白千層和大蒜。其中肉桂和香茅精油在未來竹林病害防治的應用中有很大的潛力。

此外，肉桂精油的有效抗菌成分是反式肉桂醛，香茅精油的有效抗菌成分是香葉醇、香茅醇和香茅醛，互葉白千層精油的有效抗菌成分是松油烯-4-醇，大蒜精油的有效抗菌成分是二烯丙基硫化物。這些抗菌成分之間的協同作用以及微量或未知成分的作用需進一步研究。