不同病理類型食管癌GRP78、GRP94表達及與預后的關系分析

彭 蓉，娜吧錯，益西卓呷，呂婷婷

食管癌為消化系統常見惡性腫瘤，好發于食管黏膜上皮及腺體，全球每年約有30萬人死于食管癌，我國為食管癌高發地區之一，90%以上為鱗狀細胞癌，以進行性吞咽困難、胸骨后疼痛等為主要癥狀，病因多與人群分布、飲食習慣及遺傳易感性等緊密相關[1]。因早期食管癌患者缺乏典型臨床癥狀，大多數確診時已處于中晚期，此時食管癌患者臨床治療效果差且生存率低，研究指出單純參照食管癌患者TNM分期并不能準確地判斷預后，而盡早準確判斷食管癌預后對降低其病死率有一定積極作用[2]。隨著分子生物學快速發展，越來越多研究證實腫瘤標志物與腫瘤發生、進展、預后有關[3-4]。葡萄糖調節蛋白(glucose regulatory protein， GRPs)為一種應激蛋白，在低糖及缺氧情況下其合成量明顯升高，可協助蛋白質折疊、運輸以及裝配，有學者研究證實GRP78、GRP94與人類腫瘤有關[5]；國內對不同病理類型食管癌GRP78表達及其與預后關系尚未完全明確，本研究采用免疫組化法檢測GRP78、GRP94在不同病理類型食管癌中的表達情況，通過分析GRP78、GRP94與食管癌患者病理參數及其預后的關系，以期為食管癌患者的早期診治提供有用參考信息。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集2010年1月—2014年1月在我院外科手術治療的78例食管癌石蠟包埋癌組織和30例癌旁石蠟包埋組織(癌旁組織距癌組織5 cm以上)。標本來源病例的一般資料：男42例，女36例，年齡21～68(45.12±3.16)歲；臨床分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期21例，Ⅲ期33例；病理類型：腺癌22例，鱗癌56例；分化程度：低分化34例，中分化24例，高分化20例。所有標本均經本院病理科進一步檢驗，本研究征得本院醫學倫理委員會批準同意，獲得患者知情同意，且均獲得有效隨訪。

1.2方法

1.2.1免疫組化法染色：組織切片脫蠟水化-消除內源性過氧化物酶活性-抗原修復-滴加一抗-滴加二抗-DAB顯色-染色-脫水、透明-封片；GRP78、GRP94陽性結果判定：細胞著色于細胞漿，呈棕黃色[6]，采用半定量積分法判定染色強度，每例隨機觀察5個高倍視野，取其平均值，陽性細胞所占比例≤5%記為0分，6%～25%記為1分，26%～50%記為2分，51%～75%記為3分，>75%記為4分；陽性細胞表達著色深度：不著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色各記為0、1、2、3分，兩項積分相乘所得分0～2分記為陰性，3～4分記為弱陽性，5～8分記為中陽性，9～12分記為強陽性，本研究中將≥3分記為GRP78或GRP94高表達，<3分記為GRP78或GRP94低表達。

1.2.2GRP78、GRP94 mRNA檢測：以管家基因β-actin為內參基因，應用Trizol試劑提取組織總RNA，逆轉錄試劑合成第一條DNA鏈，隨后進行PCR擴增，擴增條件：5℃，10 min；(95℃，15 s；60℃，45 s)×40；95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，15 s；60℃，15 s。擴增完畢后進行葡聚糖凝膠電泳，采用系統自帶軟件ABI Prism 7300 SDS Software分析GRP78、GRP94的mRNA表達量，每個樣本重復3次取平均Ct值(若相差0.5個Ct值舍棄)，相對定量采用2-ΔΔCt法檢測癌組織及癌旁組織中GRP78 mRNA表達情況，其中ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(管家基因)，ΔΔCt=實驗組ΔCt-對照組ΔCt。

1.2.3GRP78、GRP94蛋白相對表達量檢測：采用Western blotting檢測2組組織中GRP78、GRP94蛋白表達情況，收集GRP78、GRP94蛋白樣品，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白樣品的蛋白濃度，隨后應用SDS-PAGE凝膠試劑盒(p0012A)配制SDS-PAGE凝膠，在收集的蛋白樣品中加適量SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100℃熱水中加熱，蛋白充分變性后待其冷卻，在室溫中將蛋白樣品直接上樣至SDS-PAGE凝膠加樣孔中即可，SDS-PAGE電泳液進行電泳，待電泳時溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳，Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置進行轉膜操作(電流為300～400 mA，轉膜時間為30～60 min)，轉膜時可使用多功能電泳儀，采用快速染色液對完成轉膜的SDS-PAGE膠進行染色，隨后將蛋白膜放置在預先準備好的洗滌液中漂洗，經過一抗孵育-二抗孵育后，回收二抗，加洗滌液，共洗滌3次，采用BeyoECL pLUS試劑檢測蛋白。

1.2.4隨訪：生存時間以患者手術當日為起點，隨訪截止日期(末次隨訪時間為術后3年)或患者死亡時間為終點。

2 結果

2.1GRP78、GRP94在不同食管組織中表達情況 食管癌腺癌組織GRP78和GRP94高表達率均高于食管鱗癌組織和癌旁組織，且鱗癌組織高于癌旁組織(P<0.05)。見表1。不同食管組織中GRP78免疫組化染色情況見圖1、2。

圖1 GRP78在不同食管癌組織及癌旁組織中的免疫組化染色情況(DAB×400)

圖2 GRP94在不同食管癌組織及癌旁組織中的免疫組化染色情況(DAB×400)

表1 GRP78、GRP94在不同食管組織中表達情況[例(%)]

2.2不同病理類型食管癌組織中GRP78、GRP94 mRNA、蛋白表達情況 食管癌腺癌組織GRP78 mRNA、GRP78蛋白相對表達量明顯高于食管癌鱗癌組織，差異有統計學意義(P<0.01)。食管癌腺癌組織GRP94 mRNA、GRP94蛋白相對表達量與食管癌鱗癌組織比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、圖3。

表2 不同病理類型食管癌組織中GRP78、GRP94 mRNA、蛋白表達情況

圖3 食管癌組織中GRP78、GRP94蛋白表達情況

2.3GRP78、GRP94表達水平與食管癌臨床病理參數的關系分析 GRP78高表達率與臨床分期、分化程度、病理類型有關，而GRP94高表達率與臨床分期、分化程度有關(P<0.05)。見表3。

表3 GRP78、GRP94與食管癌臨床病理參數的關系分析[例(%)]

2.4食管癌組織中GRP78、GRP94表達與預后關系的分析 依據食管癌組織GRP78、GRP94表達水平高低分為GRP78低表達組、GRP94低表達組、GRP78高表達組、GRP94高表達組，78例食管癌患者均隨訪至術后3年，失訪率為0，隨訪結果發現GRP78低表達組術后3年生存率76.47%(13/17)明顯高于GRP78高表達組40.98%(25/61)，GRP94低表達組術后3年生存率82.61%(19/23)明顯高于GRP94高表達組36.36%(20/55)，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4、5。

圖4 GRP78高表達與低表達組食管癌患者的生存曲線GRP78為葡萄糖調節蛋白78

圖5 GRP94高表達與低表達食管癌患者的生存曲線GRP94為葡萄糖調節蛋白94

3 討論

食管癌發生發展與多種環境因素以及人類基因組相互作用有關[7]，現代醫學研究表明，食管癌演變過程為正常黏膜、基底細胞過度增生、不典型增生、原位癌、浸潤癌，隨著現代醫學水平不斷提高,食管癌手術切除率顯著升高，手術死亡率有所降低，但目前為止食管癌術后生存率仍不樂觀，主要是因為食管癌缺乏早期典型癥狀，臨床確診時多已失去最佳手術治療時機，因此食管癌早期診斷對改善患者預后尤為重要[8-9]。隨著分子生物學研究不斷深入，國內外學者發現不少與食管癌發生發展密切相關的分子生物學指標，近期有研究指出GRP78與腫瘤發生發展、耐藥、復發轉移等有關[10]，如卵巢癌、神經細胞母細胞瘤、胃癌、肺癌等腫瘤中均可檢測到GRP78表達，GRP78也被稱為免疫球蛋白重鏈結合蛋白，其作為一個重要內質網分子伴侶常定位于真核生物細胞內質網膜上，有多種功能，如參與蛋白質折疊及轉運、維持內環境穩定等生理過程[11-12]，相關研究證實GRP78可在一定程度上降低細胞對殺傷性T細胞的敏感度，阻礙細胞凋亡，而腫瘤細胞同樣存在GRP78的保護作用，GRP78同樣可降低細胞毒性T細胞對腫瘤細胞殺傷力，促進腫瘤細胞增殖以及耐藥性產生[13-14]。食管癌作為全球范圍內危害人類生命安全的常見惡性腫瘤，早期準確診斷其病理類型及預后對降低患者病死率有重要臨床意義。

GRP78、GRP94是糖調節蛋白家族中被研究最多的蛋白，主要在內質網中穩定表達，在基礎表達水平上發揮重要的生理作用，董孝成等[15]對不同組織學類型食管癌GRP78表達及其臨床病理特征的相關性進行了探究，結果發現食管癌腺癌組織GRP78陽性率明顯高于食管癌鱗癌組織及正常食管組織，同時證實了GRP78可能參與了食管癌變發生過程；而胡永偉等[16]文獻報道則表明GRP78陽性患者的中位生存期為49.78個月(95%CI:44.09,55.46個月)短于陰性患者的62.21個月(95%CI:53.29,71.14個月)；Hsu等[17]研究也證實GRP78在腫瘤組織中呈高表達；關心等[18]研究則證實結直腸癌組織中GRP78、GRP94高表達可能與結直腸癌發生、生長、侵襲、轉移及預后有關，或可作為腫瘤進展和預后的客觀指標。本研究發現，食管癌鱗癌組織GRP78、GRP94高表達率較食管癌癌旁組織明顯高，證實了GRP78、GRP94可能參與了食管癌疾病發生、發展病理過程中，與李洪標等[19]研究的觀點大體相符；本研究結果還顯示，食管癌腺癌組織GRP78 mRNA和蛋白相對表達量明顯高于食管癌鱗癌組織，提示術前監測食管癌患者GRP78表達水平或有利于臨床醫師為食管癌患者制定合理治療方案[20]。此外，本研究隨訪結果發現，GRP78、GRP94低表達組術后3年生存率高于GRP78、GRP94高表達組，提示GRP78、GRP94水平高低可較好預測食管癌患者預后狀況，未來GRP78、GRP94有望成為判斷食管癌預后的有效指標。

綜上所述，本研究的創新之處是，初步證實了GRP78、GRP94與食管癌病理特征及其預后的關系，為食管癌患者的早期診斷、預后評估等方面提供了理論依據，臨床中或可通過嚴密監測食管癌組織中GRP78表達情況，以預測腫瘤的惡性程度和預后狀況。