糞便SFRP2基因甲基化聯合定量免疫便潛血檢測在結直腸癌篩查的應用

康 倩, 謝 惠, 王 昕, 張 杰, 李 娜, 盛劍秋

(中國人民解放軍總醫院第七醫學中心消化內科，北京 100700)

結直腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤，發病率和死亡率逐年增加[1]。有效的篩查可降低結直腸癌發病率和死亡率[2]。糞便潛血檢測操作簡便，費用低，依從性高，被臨床上廣泛應用于早期結直腸癌的初篩,但存在診斷效能低和假陽性率高的問題[3]。糞便SFRP2基因甲基化是結直腸癌新的分子標志物[4]。本研究將傳統的定量免疫便潛血聯合糞便SFRP2基因甲基化檢測給結直腸癌篩查提供新的思路，并取得較好的篩查效果，現報道如下：

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2018年01月至2018年12月在我中心消化科門診行結腸鏡檢查和病理檢查確診的106例結直腸癌患者為研究對象，同時選取106例進展性腺瘤患者及106例健康人群，結直腸癌患者包括男65例，女41例，年齡45～78歲，平均年齡(68.01±6.58)歲；進展性腺瘤患者中男62例，女43例，年齡48～77歲，平均年齡(65.16±7.32)歲，健康人群中男63例，女42例，年齡47～80歲，平均年齡66.42±6.48歲，納入標準：①無其它部位腫瘤；②首次確診，無復發和轉移；③未進行化療。排除標準：①曾接受放化療；②非原發癌灶者及不能確診等其他情況；③肉眼見血性大便者。三組研究對象年齡、性別差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。三組人群糞便標本收集于無菌容器。標本于24h內保存于-80℃冰箱待測。本研究經中心倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2方 法

1.2.1糞便DNA提取，用QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen，德國)從糞便標本(250 mg)分離DNA，-80 ℃保存備用。

1.2.2亞硫酸氫鹽處理 用EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen，德國) 對基因組DNA 進行轉化和純化。

1.2.3甲基化特異性PCR 重亞硫酸鹽修飾的DNA 作為模板,引物設計見表1，反應條件為：98 ℃ 10 s，非甲基化引物50 ℃退火30 s，甲基化引物62 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s，40 個循環。在2.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳分離，然后在紫外光凝膠成像系統中觀察結果。

表1 SFRP2引物序列

1.2.4定量免疫便潛血法檢測：日本榮研化學株式會社生產的OC-SENSOR Micro自動糞便隱血檢測儀及配套試劑、質控品、校準品。嚴格按操作規程執行，儀器自動生成打印檢測結果，以血紅蛋白濃度≥100 ng/mL 為陽性。

1.3統計分析:應用SPSS17.0 統計軟件處理數據，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05表示有統計學意義。

2 結 果

結直腸癌組、進展性腺瘤組糞便SFRP2基因甲基化陽性檢出率均高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，結直腸癌組高于進展性腺瘤組，差異具有統計學意義(P<0.05)，詳見表2。結直腸癌組、進展性腺瘤組定量免疫便潛血陽性檢出率均高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，結直腸癌組高于進展性腺瘤組，差異具有統計學意義(P<0.05)，詳見表3。結直腸癌組、進展性腺瘤組SFRP2甲基化聯合定量免疫便潛血陽性檢出率均高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，結直腸癌組高于進展性腺瘤組，差異具有統計學意義(P<0.05)，詳見表4。糞便中SFRP2基因甲基化，定量免疫便潛血以及聯合檢測的靈敏性分別為77.35%，83.96%和93.40%，特異性分別為93.40%，98.11%和93.40%。聯合檢測在不降低特異性情況下，靈敏性較單獨檢測顯著增高，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組糞便SFRP2甲基化檢出率

表3 各組定量免疫便潛血陽性檢出率

表4 SFRP2甲基化聯合定量免疫便潛血陽性檢出率

3 討 論

結直腸癌早期沒有明顯特征，大多在中晚期才被確診，故早期篩查結直腸癌可明顯提高治療效果和延長生存時間[4]。腸鏡聯合病理檢查在診斷結直腸癌中的靈敏性和特異性最高，但國內醫療資源相對缺乏，同時患者依從性較差，不適合用于大規模篩查。糞便潛血實驗作為結直腸癌篩查重要手段，已在臨床應用幾十年。定量免疫便潛血法采用免疫比濁法，通過乳膠凝集光學檢測技術自動檢測對糞便中血紅蛋白進行定量檢測，檢測精度高，線性范圍寬,靈敏度高，但還存在一定的假陽性[5]。最近研究顯示，表觀遺傳學在結直腸癌發生發展中發揮重要作用[6]。由于在糞便中能檢測甲基化，分析糞便的異常甲基化可能為非侵襲性檢測結直腸癌提供一種新的策略。因此本研究采用聯合SFRP2基因甲基化作為篩查手段，提高篩查效率。

本研究結果顯示結直腸癌組、進展性腺瘤組糞便SFRP2基因甲基化陽性檢出率以及定量免疫便潛血陽性檢出率均高于對照組(P<0.05)，而且結直腸癌組高于進展性腺瘤組(P<0.05)。SFRP2甲基化聯合定量免疫便潛血聯合檢測用于結直腸癌組、進展性腺瘤組檢出率明顯高于對照組(P<0.05)，結直腸癌組高于進展性腺瘤組(P<0.05)。二者聯合檢測在不降低特異性情況下，靈敏性高于單獨檢測(P<0.05)。SFRP2基因甲基化而導致轉錄沉默,作為Wnt信號負調節劑誘導腫瘤細胞增殖分化，與結直腸癌密切相關[7]。本文結果說明在健康人群中SFRP2基因發生甲基化的比例極低，而在結直腸腫瘤中甲基化比例顯著增加，在結直腸癌中比例最高，隨著結直腸癌進展，甲基化狀態改變越明顯。聯合檢測篩查結直腸癌可能會提高篩查的準確性，可作為初步篩查結直腸癌的策略。綜上所述，SFRP2甲基化聯合定量免疫便潛血可以提高篩查結直腸癌準確性，可作為社區篩查結直腸癌常規手段，值得臨床推廣應用。