MRSA耐藥性檢測及SCCmec基因分型分析

屠雷鈞 葉永志 林 婭 邊保華

自1961年英國學者Jevons首先發現了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA），隨后在世界各國陸續發現，已成為醫院內感染的重要病原菌之一［1-3］。2012年中國醫院細菌監測網監測結果顯示，在我國MRSA感染在SA中所占比例達47.9%［4］。MRSA具有致病力強、傳播速度快、耐藥性強、耐藥譜廣的特點，對人類健康構成嚴重威脅，其造成的感染與乙型肝炎、艾滋病并列成為世界三大難解決的感染性疾病之一［5］。MRSA的耐藥主要是因為葡萄球菌染色體mec基因盒（CSSmec）中攜帶甲氧西林耐藥決定子A（mecA）。且SCCmec型別較多，不同地區MRSA的SCCmec流行型別不同，其耐藥特性也有所不同。為了解本院住院患者MRSA感染、SCCmec流行型別及耐藥特征，將臨床住院患者各類標本中分離的金黃色葡萄球菌（SA）作MRSA檢測、基因分型及耐藥性分析，報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 157株SA為臺州市中西醫結合醫院2018年1月至12月住院患者痰液、膿汁、血液、尿液等各種標本分離所得，排除同一部位重復的菌株。

1.2 質控菌株 金黃色葡萄球菌ATCC43300（MRSA菌株）、金黃色葡萄球菌ATCC25923（MSSA菌株）均購自中國菌種保藏中心。

1.3 主要試劑與儀器 血平板、MH平板、5%羊血哥倫比亞瓊脂平板、MH肉湯等均為杭州天和微生物試劑公司產品；各種藥敏紙片均為英國Oxoid產品；細菌基因組提取試劑盒為上海生工生物工程（股份）有限公司產品；VITEK-2Compact全自動微生物分析儀和革蘭陽性細菌鑒定片為法國梅里埃公司產品；PCR擴增儀BIO-RAD S1000 Thermal cycle、凝膠電泳儀和成像系統均為美國BIO-RAD公司產品。

1.4 方法 （1）SA的培養與鑒定：以《全國臨床檢驗操作規程》為標準進行分離培養［6］，并經法國梅里埃VITEK-2Compact型全自動細菌分析儀進行鑒定。（2）MRSA表型檢測：采用頭孢西丁瓊脂擴散法，操作方法及結果判斷按美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）推薦的標準［7］。以金黃色葡萄球菌ATCC25923和金黃色葡萄球菌ATCC43300作質控。（3）MRSA基因檢測：①MRSA基因組DNA提取：采用上海生工生物工程（股份）有限公司生產的細菌基因組提取試劑盒提取細菌DNA。嚴格按試劑盒說明書操作。提取液質量的檢測用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。②mecA及SCCmec基因分型檢測：引物設計：mecA及SCCmec基因擴增引物委托上海生工生物工程（股份）有限公司合成。見表1和表2。聚合酶鏈反應（PCR）擴增體系及條件：PCR擴增總體系均為50μl：dNTPs混合液（2.5mmol/L）4μl，10× 緩沖液 5μl，上下游引物（25μmmol/L）各1μl，Taq酶0.5μl，鎂離子0.5μl，DNA模板1μl，雙蒸餾水補足至50μl。擴增條件：94℃預變性2min，94℃變性 60s，55℃退火 60s，72℃延伸 60s，循環35個周期，最后72℃延長至10min。取PCR產物5 μl在1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色紫外燈下成像，觀察分析結果。

表1 PCR擴增mecA基因引物序列

表2 PCR擴增SCCmec基因引物序列

1.5 基因測序及分析 將PCR產物送上海生工生物工程（股份）有限公司純化測序。測序結果經Gen Bank序列數據庫中采用BLAST程序進行核苷酸序列比對，確定基因型。

1.6 藥敏試驗 采用K-B紙片擴散法，以CLSI標準進行操作和結果判斷［7］，采用金黃色葡萄球菌ATCC25923和金黃色葡萄球菌ATCC43300作質控菌株。

2 結果

2.1 MRSA菌株表型檢測結果 157株分離自臨床各類標本的SA經表型檢測有76株陽性，初篩陽性率為48.41%。

2.2 MRSA菌株基因檢測及SCCmec分型結果 76初篩陽性的菌株，再經PCR檢測mesA基因，電泳結果在147bp處有73株出現DNA陽性條帶，MRSA確證試驗陽性率為46.50%。PCR電泳結果見圖1。73株確證為MRSA菌株經PCR檢測SCCmec基因型，結果在280bp處出現41條DNA陽性條帶，在398bp處出現27條DNA陽性條帶，在200bp處出現2條DNA陽性條帶，尚有3株無法分型。PCR電泳結果見圖2。

圖1 mecA基因PCR擴增電泳圖

圖2 SCCmec分型PCR基因擴增電泳圖

2.3 基因序列測序結果 PCR陽性產物經純化測序，并與Gen Bank序列數據庫提供的SCCmec序列比對，結果確定200bp處陽性條帶為SCCmecⅣ型，280bp處為SCCmec型，398bp處為SCCmecⅡ型。

2.4 藥敏試驗結果 SCCmecⅡ型與Ⅲ型對萬古霉素、替考拉寧具有極高敏感性，相反對β-內酰胺類抗菌藥物100%耐藥，對其他常用抗菌藥物也有較高耐藥性，但SCCmecⅡ菌株耐藥率顯著低于SCCmecⅢ菌株，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 主要MRSA菌株不同SCCmec基因型的耐藥結果（%）

3 討論

MRSA具有較強的致病力，且具有多重耐藥性的特點，備受臨床醫師高度關注。本資料結果顯示，MRSA表型檢測有76株陽性，初篩陽性率48.41%。由于MRSA產生的耐藥是因MRSA獲得mesA基因，mecA基因能編碼產生新的青霉素結合蛋白2a（PBP2a），造成對β-內酰胺類藥物耐藥，CLSI明確指出一旦在金黃色葡萄球菌中檢測到mecA基因，即可認定MRSA［8］。據此，采用PCR技術將76株表型陽性菌株經mecA特異性檢測，結果有73株PCR反應擴增到147bpDNA片段，MRSA確證陽性率為46.50%，該結果與2012年中國細菌耐藥性監測網所監測的全國MRSA平均檢出率47.9%基本相一致［5］，高于應建飛報道的37.28%［9］，表型與基因型檢測符合率為96.05%。另3株表型檢測雖然陽性，能表達β-內酰胺酶，但菌株未攜帶mecA基因，其原因據學者報道認為一旦SA細胞壁增厚變粗也能導致表型陽性而對β-內酰胺類藥物耐藥［10］。

SCCmec是一個能移動的遺傳基因元件，由mecA等多種基因構成，還攜帶有多種質粒和轉座子，編碼除對β-內酰胺類藥物耐藥外，還能編碼產生對多種抗菌藥物耐藥。依據SCCmec盒上基因復合體的組成不同，SCCmec有多種型別，SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型主要見于醫院感染獲得性MRSA（HA-MRSA），SCCmecⅣ、Ⅴ型主要見于社區獲得性MRSA（CAMRSA）。這幾年又陸續發現其他新的型別SCCmec。SCCmecⅠ型是最早發現，所帶耐藥基因少，大多數對非β-內酰胺類藥物敏感。SCCmecⅡ、Ⅲ型含耐藥基因比Ⅰ型要多，且多種耐藥基因整合在一起，表現為對多種抗菌藥物耐藥。相對SCCmecⅢ型要比Ⅱ型攜帶耐藥基因更多，故其耐藥性更強更廣些。SCCmecⅣ、Ⅴ型分子較小，且基因較穩定，僅攜帶mecA基因，不帶有其他耐藥基因［11］，因此，對非β-內酰胺抗生素大多敏感。不同型別SCCmec在不同國家和不同地區流行也不相同，亞洲地區MRSA流行型別以SCCmecⅡ型為主，在我國南北地區流行菌株的基因型也有差異，北方對SCCmecⅡ型為主，而南方則以SCCmecⅢ型為主［12］。本資料結果顯示，本組MRSA流行菌株主要是SCCmecⅢ型，由于SCCmecⅢ型攜帶有更多的耐藥基因整合在一起，還可通過質粒等途徑在葡萄球菌間傳播而造成多重耐藥，應引起臨床醫師高度關注。

SCCmecⅡ型與Ⅲ型對萬古霉素、替考拉寧具有極高敏感性，未見耐藥菌株，對β-內酰胺類藥物100%耐藥，對其他抗菌藥物也有較高耐藥性，但SCCmecⅡ型菌株對氨基糖苷類、大環內酯類、喹諾酮類、四環素類和林可霉素類的耐藥性顯著低于SCCmecⅢ型菌株。表明SCCmecⅢ型菌株比Ⅱ型菌株攜帶有更多的耐藥基因整合在一起，且mecA基因與其耐藥基因緊密相鄰而連鎖，造成更為嚴重耐藥。利奈唑胺對MRSA具有很高敏感性，極少見到耐藥報道，但在本資料中尚有1株SCCmecⅢ型菌株產生耐藥，據報道可能與23S核糖體RNA 突變或cfr基因介導的2503位腺嘌呤甲基化有關［13］，有待今后工作中進一步加以研究。

了解MRSA在臨床感染率及SCCmec基因型在當地的流行情況，對防控MRSA菌株在院內流行及耐藥性分析具有重要意義。