β-arrestin2 AQPs與阿片類藥物相關性便秘的相關性分析

葉旭星 馬雙雙 王曉波

阿片類藥物相關性便秘（OIC）是指應用各種阿片類鎮痛藥引起的便秘，發生率達70%～95%，嚴重影響癌痛患者的生存質量，更有甚者因發生嚴重便秘、抑或導致腸梗阻而停止治療。阿片類藥物相關性便秘的發生與阿片和胃腸道內μ受體結合，影響胃腸動力及腸液分泌，并出現結腸傳輸減慢及排便反射抑制相關［1］。其具體作用機制尚不清楚［2］。有動物實驗證實β抑制蛋白2（β-arrestin2）與OIC的發生密切相關［3］，而腸液分泌及腸道內水分的重吸收與水通道蛋白（AQPs）密切相關［4］。本文探討β-arrestin2與AQPs與OIC的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年1月至12月本院傳統醫學中心及介入科接受治療的Ⅲa期、Ⅲb期肝癌合并OIC的患者60例，男49例，女11例；年齡18～80歲，平均年齡（62.39±9.51）歲。Ⅲa期7例，Ⅲb期53例。診斷標準：符合《原發性肝癌診療規范（2017年版）》Ⅲ期肝癌診斷標準［5］，并參照美國多學科工作組制定的OIC診斷標準：口服羥考酮緩釋片>1周，出現大便干結、排便費力、排便不盡，且自主排便<3次/周。羥考酮使用劑量40（20，70）mg，介入次數（<3次50例，≥3次10例）。60例患者均接受肝動脈化療栓塞術。肝動脈化療栓塞采用100～300μm加載60mg注射用鹽酸表柔比星的載藥微球栓塞。癌痛按規范化治療，采用羥考酮緩釋片10mg行劑量滴定治療，治療期間不予任何其他止痛藥及胃腸動力藥。另選擇同期未服用阿片類藥物且無便秘的肝癌患者30例為對照組，男24例，女6例，平均年齡（61.39±10.16）歲。Ⅲa期 3例，Ⅲb期 27例。兩組患者年齡、性別構成，疾病程度等方面差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 納入與排除標準 納入標準：（1）年齡18～80歲服用羥考酮緩釋片止痛的肝癌患者。（2）符合本病診斷標準。（3）患者自愿接受檢測并簽署知情同意書。排除標準：（1）糖尿病胃腸神經病變、腹部手術腸粘連等器質性病變者；（2）病情進展，如肝癌破裂出血、肝衰竭、腹腔感染，需介入其他治療；（3）服用止吐藥、促腸動力藥、鈣離子拮抗劑、非阿片類止痛藥等影響胃腸動力；（4）自身存在便秘；（5）合并有其他系統疾患者，如精神疾病、心血管疾病、腎功能不全等；（6）依從性差的患者。

1.3 觀察指標 （1）Bristol分型：Ⅰ型為散硬塊或球狀；Ⅱ型為團塊臘腸狀；Ⅲ型為裂紋臘腸狀；Ⅳ型光滑臘腸狀；Ⅴ型為柔軟團狀；Ⅵ型為糊狀便；Ⅶ型為水樣便。（2）BFI量表：患者便秘癥狀的情況采用腸功能指數（BFI）量表進行評分。BFI 量表從排便難易程度、排便不盡感及便秘總體評價3個維度進行評分，每項均用0～100分數字評估，之后取平均值，分數越高表明便秘程度越嚴重。（3）β-arrestin2表達：所有患者均清晨空腹抽取肘靜脈血5ml，靜置1h后用半徑為8cm的離心機3500r/min離心15min，分離血清后，-80℃冰凍保存待查。采用酶聯免疫法（ELISA）測定，選用上海鈺博生物科技有限公司的人β-arrestin2試劑盒。（4）RT-PCR法檢測AQPs mRNA：采集靜脈血5ml，充分混勻，離心，分離血漿，凍于-80℃冰凍保存待測。檢測時按照試劑盒說明提供的實驗步驟用Trizol法提取血清總RNA。根據qPCR 試劑盒說明書操作，使用RQ manager 數據分析軟件得到樣品閾值循環數（Cycle threshold，Ct）。測得 Ct值采用 2-ΔΔCt法測算AQPs mRNA的表達量，以β-actin作為內參基因，將對照組的基因表達率歸為1，并以AQPs mRNA/β-actin表示。應用Primer Premier 6.0軟件分別設計其PCR引物，引物由Invitrogen公司合成。見表1。

表1 AQPs及內參基因引物序列

1.4 統計學方法 采用SPSS 23.0統計軟件。制圖采用Graphpad Prism 6.01及Photoshop cs5軟件。三組間計量資料比較采用單因素方差分析；等級資料相關性分析采用spearman相關性檢驗；計量資料線性相關性分析采用pearson檢驗；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 β-arrestin2與OIC的 相 關 性 β-arrestin2在羥考酮小劑量組與中劑量組［（391.56±43.37）vs. （426.66±34.33）］ng/L，小劑量組與大劑量組［（391.56±43.37） vs. （472.53±32.17）］ng/L差異有統計學意義（P<0.05）。且存在羥考酮日劑量用量越大，β-arrestin2 水平越高（r2=0.2814，P<0.01）。β-arrestin2與BFI也存在正相關（r2=0.1565，P=0.0018）。見圖1。

2.2 AQPs mRNA與Bristol的相關性 AQPs mRNA/β-actin分別與Bristol分型進行相關性分析，顯示AQP2 mRNA/β-actin與Bristol分型存在正相關（r2=0.2568，P<0.01），而 AQP3 mRNA/β-actin、AQP4 mRNA/β-actin、AQP8 mRNA/β-actin 與 Bristol 分型均存在負相關（r2=0.1764、0.3673、0.3879，均P<0.01）。見圖 2。

圖1 β-arrestin2與OIC的關系

圖2 AQPs mRNA與Bristol的關系

2.3 β-arrestin2與AQPs mRNA的 相 關性 β-arrestin2與 AQP2 mRNA/β-actin呈 負 相 關（r2=0.1250，P=0.0056）， 而 與 AQP3 mRNA/β-actin、AQP4 mRNA/β-actin、AQP8 mRNA/β-actin均 呈 正相關（r2=0.1661、0.0713、0.3983，P=0.0012、0.0392、<0.0001）。見圖 3。

圖3 β-arrestin2與AQPs mRNA的相關性

3 討論

β-arrestin2是一種多功能蛋白，參與G蛋白偶聯受體（GPCRs）的跨膜信號轉導，催化三磷酸腺苷（ATP）生成環磷酸腺苷（cAMP）［6］，使細胞外信號轉化為細胞內信號。此通路與阿片類物的鎮痛及OIC的發生關系密切，并在動物實驗中已經得到證實［7］。研究證實水通道蛋白（AQPs）參與腸道對于水的重吸收及消化液的分泌，與便秘的發生密切相關［8］。而cAMP-PKA信號通路能介導AQPs的運輸、門控以及重新分布［9］。因此，作者推斷β-arrestin2-cAMP-AQPs可能是阿片類藥物相關性便秘的信號通路之一。

本資料結果顯示，β-arrestin2與羥考酮日劑量及BFI間均存在正相關（P<0.05），表明β-arrestin2與阿片類藥物相關性便秘相關，這與動物實驗中證實的β-arrestin2介導的信號通路與阿片類藥物相關性便秘密切相關相一致［3］。AQP2 mRNA/β-actin與Bristol分型存在正相關（r2=0.1250，P=0.0056）。相反，AQP3 mRNA/β-actin、AQP4 mRNA/β-actin、AQP8 mRNA/β-actin與Bristol分型均存在負相關（r2=0.1661、0.0713、0.3983，均 P<0.01），表明 AQP2與糞便含水量呈正相關，AQP3、AQP4、AQP8與糞便含水量呈負相關。因此，推斷AQP2可能與腸液分泌有關，而AQP3、AQP4、AQP8均可能與腸道水分重吸收相關。β-arrestin2與AQPs mRNA的相關性分析顯示，β-arrestin2與AQP2 mRNA/β-actin呈負相關，而與AQP3 mRNA/β-actin、AQP4 mRNA/β-actin、AQP8 mRNA/β-actin均呈正相關，推斷β-arrestin2可能參與調控AQPs的運輸、門控以及重新分布。

綜上所述，β-arrestin2、AQPs均與OIC存在相關性，且β-arrestin2-cAMP-AQPs可能是阿片類藥物相關性便秘的信號通路之一，具體機制有待進一步研究。