環(huán)狀RNA Hsa_circ_0102434在胃癌中的表達(dá)及其臨床價(jià)值研究

張晨靜 王婧雅 耿曉歌 潘文勝

全球范圍內(nèi)，胃癌（GC）發(fā)病率和病死率分別位列惡性腫瘤的第2位和第3位。我國胃癌每年新發(fā)病例為67.91萬，死亡病例為49.8萬，發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)均高居惡性腫瘤第2位，且呈現(xiàn)上升趨勢［1］。研究表明ncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［2］。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是由反向剪接反應(yīng)（back-splicing）的特殊剪接機(jī)制形成的、具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)、大量存在于真核轉(zhuǎn)錄組中的一類特殊的非編碼RNA［3］。相較于線性非編碼RNA，circRNA分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定。有研究表明 circRNA 可以在轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后等多個(gè)層面上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，對機(jī)體的多種生理及病理過程起著重要的調(diào)控作用［3］。本文探討環(huán)狀RNA Hsa_circ_0102434在胃癌中的表達(dá)及其臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年5月至2018年7月浙江大學(xué)第二附屬醫(yī)院和浙江省人民醫(yī)院的原發(fā)性胃癌患者，選擇術(shù)前未行放療及化療的患者46例。采集所有患者術(shù)中腫瘤組織和距離腫瘤>5cm的正常癌旁組織。手術(shù)切除后，收集組織樣品并在液氮中冷凍，然后再檢測。本研究經(jīng)杭州醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)（2018KT085）。

1.2 方法 （1）RNA提取和純化：通過TRIzol（美國Invitrogen公司）提取每個(gè)樣品的總RNA，使用Agilent 2100生物分析儀檢查RNA的濃度、純度和完整性。然后，使用SuperScriptTM IV合成系統(tǒng)（美國，Invitrogen）將RNA純化并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。（2）熒光定量PCR：采用TB GreenTM Premix DimerEraserTM（完美實(shí)時(shí)）在ABI 7900 Real-Time PCR System（美國Thermo Fisher Scientific）上通過qRT-PCR擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參，校正每個(gè)樣本的Ct，計(jì)算△Ct值，以2-△△Ct計(jì)算基因表達(dá)。將PCR產(chǎn)物送廣州吉賽生物公司科技有限公司進(jìn)行測序，以確保環(huán)狀RNA檢測的準(zhǔn)確性。見表1。

表1 用于qRT-PCR檢測的引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0及GraphPad Prism 5.0軟件統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)。Hsa_circ_0102434的表達(dá)水平與患者臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系用單因素方差分析（ANOVA）。利用ROC曲線分析環(huán)狀RNA在組織中的表達(dá)差異作為胃癌診斷指標(biāo)的可能性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)狀RNA Hsa_circ_0102434在胃癌組織中表達(dá) 與癌旁組織相比，Hsa_circ_0102434在胃癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)（P=0.0002）。見圖1。將PCR產(chǎn)物送吉賽公司測序，結(jié)果確認(rèn)該序列為帶有反向剪接位點(diǎn)的Hsa_circ_0102434。見圖2。

圖1 Hsa_circ_0102434在胃癌組織及癌旁組織中表達(dá)水平

圖2 剪切位點(diǎn)測序圖

2.2 胃癌組織中環(huán)狀RNA Hsa_circ_0102434表達(dá)量與臨床病理特征的相關(guān)性 將胃癌組織中環(huán)狀RNA Hsa_circ_0102434的表達(dá)量取中位數(shù)分為低表達(dá)組與高表達(dá)組，進(jìn)一步分析患者Hsa_circ_0102434表達(dá)水平與其臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，Hsa_circ_0102434高表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)（P<0.05），與性別、年齡、腫瘤大小、病理分期、腫瘤分化程度、血管浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（見表2）。

表2 環(huán)狀RNA Hsa_circ_0102434的表達(dá)水平與胃癌臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系

2.3 環(huán)狀RNA Hsa_circ_0102434可作為胃癌的診斷標(biāo)志物 為了進(jìn)一步研究RNA Hsa_circ_0102434對胃癌的診斷價(jià)值，以Hsa_circ_0102434在組織中的表達(dá)作為指標(biāo)繪制ROC曲線（見圖3），結(jié)果顯示曲線下面積 0.743（95%CI 0.642～0.844，P<0.0001），敏感度和特異度分別是78.3%和60.9%，診斷臨界值是1.605，約登指數(shù)為0.392。

圖3 Hsa_circ_0102434的ROC曲線

3 討論

環(huán)狀RNA曾經(jīng)被認(rèn)為是由低豐度和技術(shù)局限性引起的剪接錯(cuò)誤的副產(chǎn)物，而近年來，隨著RNA-seq和生物信息學(xué)分析的發(fā)展，環(huán)狀RNA受到廣泛關(guān)注。與線性RNA不同，cir-cRNA通過外顯子環(huán)化或內(nèi)含子環(huán)化將3'和5'末端連接在一起形成共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)。環(huán)狀RNA在生物中豐富，多樣且穩(wěn)定。較多研究人員發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA在調(diào)控中起重要作用［1-3］。最近研究也發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但其作用機(jī)制尚不清楚。

一些研究發(fā)現(xiàn)circRNA可作為微小RNA海綿（miRNA sponge）發(fā)揮作用［4］，例如，在肝癌中CDR1as高表達(dá)，能夠通過抑制miRNA-7發(fā)揮促癌作用［5］；又如，circHIPK3通過抑制miRNA-124調(diào)控腫瘤生長［6］。全基因組研究表明miRNA海綿機(jī)制并非普遍適用［3，7］，其它一些機(jī)制也相繼被提出。最近研究發(fā)現(xiàn)，在某些特殊情況下，環(huán)狀RNA脫離其非編碼RNA的屬性（不能編碼蛋白質(zhì)），可作為蛋白質(zhì)合成過程中的翻譯模板，指導(dǎo)功能蛋白的合成［8］。如環(huán)狀RNA來源的蛋白質(zhì)/多肽在肌形成以及細(xì)胞應(yīng)激過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能［9-10］；環(huán)狀RNA SHPRH能夠通過合成一種新型蛋白參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展［11］。越來越多研究表明，環(huán)狀RNA在腫瘤的發(fā)生和腫瘤的發(fā)展中起著重要的作用。如，Hsa_circ_0001649在肝細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)［12］；Hsa_circ_100855和Hsa_circ_104912在喉鱗狀細(xì)胞癌（LSCC）組織中表達(dá)失調(diào)［13］；胃癌Hsa_circ_002059表達(dá)的降低與遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，TNM分期，性別和年齡顯著相關(guān)［14］。作者前期應(yīng)用高通量測序?qū)ξ赴┙M織及癌旁組織分析發(fā)現(xiàn)Hsa_circ_0102434在胃癌組織及癌旁組織中差異表達(dá)，進(jìn)一步qRT-PCR研究結(jié)果顯示Hsa_circ_0102434在胃癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Hsa_circ_0102434的表達(dá)與胃癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是評估腫瘤的關(guān)鍵因素，提示Hsa_circ_0102434可能與胃癌的進(jìn)展關(guān)系密切。本資料顯示，Hsa_circ_0102434對胃癌的診斷結(jié)果顯示曲線下面積 0.743（95%CI 0.642～0.844，P<0.0001），具有較高的診斷效能，以1.605為診斷臨界值，敏感度和特異度分別為78.3%和60.9%，提示將胃鏡常規(guī)活檢組織行Hsa_circ_0102434檢測作為潛在胃癌診斷方法，為開發(fā)新型胃癌診斷標(biāo)志物提供基礎(chǔ)。

綜上所述，Hsa_circ_0102434在胃癌組織中表達(dá)升高，與胃癌進(jìn)展關(guān)系密切，同時(shí)對胃癌具有一定的診斷價(jià)值，是篩查胃癌的潛在生物標(biāo)志物。