雙酚A對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的影響初探

葛勇 徐甜甜 陳一蘭 吳懿 包明蒽 柴惠

目前，已有近千種化學(xué)物質(zhì)被確定為潛在的內(nèi)分泌干擾物，其有可能改變內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能，從而對一個完整的生物體或其后代造成不利影響［1］。雙酚A（BisphenolA，BPA）是一種烷基酚類環(huán)境雌激素，是世界上產(chǎn)量最高的內(nèi)分泌干擾物之一［2］。BPA被大量使用于塑料和玩具、醫(yī)療設(shè)備等塑料制品中，能夠通過與人體不斷接觸從而使雌激素在機體內(nèi)慢性蓄積［3］。雌激素在較多器官和系統(tǒng)的形成及功能中起重要作用，其不平衡會增加人類癌癥和生殖、神經(jīng)、代謝、免疫及心血管系統(tǒng)疾病的風險［4］。BPA可能通過影響血管細胞粘附分子-1（VCAM-1）和細胞間粘附分子-1（ICAM-1）等多種細胞因子的表達影響心血管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能。2018年12月至2019年11月作者通過實驗研究，探討B(tài)PA對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）活性的影響以及對心血管系統(tǒng)的作用，進而分析環(huán)境雌激素在心血管疾病發(fā)展中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞 HUVEC細胞株（購自美國ATCC公司）。

1.2 藥品與試劑 BPA（美國Sigma）、DMEM高糖培養(yǎng)基（上海吉諾）、胎牛血清（杭州四季青）、二甲基亞砜DMSO（美國Sigma）、MTT染料（上海拜力）、TRIZOL（美國Ambion）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康為世紀）、Ultra SYBR Mixture（北京康為世紀）、BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo）。

1.3 主要儀器 CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo）、倒置顯微鏡（日本尼康）、臺式高速低溫離心機（德國Eppendorff）、酶標分析儀（美國Biotek）、PCR擴增儀（美國Bio-RAD）、熒光定量PCR儀（Step One Plus? Real-Time PCR System，美國 ABI）、Q5000 超微量核酸蛋白測定儀（美國Quawell）、凝膠成像儀（美國 Bio-RAD）。

1.4 方法 （1）HUVEC細胞培養(yǎng)：將HUVEC細胞培養(yǎng)于DMEM高糖型培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清）中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔48h更換培養(yǎng)液，并在顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)。當細胞融合率>80%時，按1∶2的比例傳代培養(yǎng)。（2）MTT法分析BPA對HUVEC細胞抑制率的影響：將處于對數(shù)生長期的HUVEC細胞種于96孔板中。培養(yǎng)24h后，設(shè)置空白對照組（DMEM培養(yǎng)液），溶劑對照組（含1‰的無水乙醇）和BPA干預(yù)組（BPA濃度分別為10-3μmol/L，10-2μmol/L，10-1μmol/L，1μmol/L，10μmol/L，102μmol/L，103μmol/L），每組設(shè)置 6個復(fù)孔。處理24h后，每孔各加MTT溶液20μl并搖勻，37℃溫育4h。棄去原有液體，加入150μl DMSO，反應(yīng)15min。在酶標儀中以490nm測定吸光度（OD值），并計算細胞抑制率（抑制率=1-ODBPA干預(yù)組/OD空白對照組）。（3）HUVEC 細胞中 VCAM-1和ICAM-1的mRNA和蛋白質(zhì)表達測定：①HUVEC細胞分組處理：將處于對數(shù)生長期的HUVEC細胞種于24孔板中。培養(yǎng)24h后，設(shè)置空白對照組（DMEM培養(yǎng)液），溶劑對照組（含1‰的無水乙醇）和BPA干預(yù)組（BPA濃度分別為0.5μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，50μmol/L，200μmol/L，500μmol/L），每組設(shè)置3個復(fù)孔。②HUVEC細胞mRNA的提取：各組加Trizol裂解細胞，常規(guī)提取mRNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配制20μl體系反應(yīng)液，置于PCR儀中，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。③實時熒光定量PCR檢測HUVEC細胞中VCAM-1、ICAM-1的mRNA表達水平：PCR反應(yīng)體系為2×Ultra SYBR Mixture 10μl，VCAM-1/ICAM-1/β-actin上 下 游 引 物 各 0.5μl，Template DNA 1μl，RNase-Free Water 8μl，共計 20μl。引物序列設(shè)計及合成由上海桑尼生物科技有限公司完成。VCAM-1 上游 ：5'-CCAGAATCTAGATATCTTGCTC-3'，下 游 ：5'-CAGCCTGTCAAATGGGTATAC-3'；ICAM-1上 游 ：5'-TGAACAGAGTGGAAGACATATGCC-3'， 下游：5'-TCAGATGCGTGGCCTAGTGTT-3'；β-actin上游：5'-AAATGCTTCTAGGCGGACTATGA-3'， 下 游：5'-TTTCTGCGCAAGTTAGGTTTTG-3'。實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，95℃變性15s，60℃退火/延伸1min，擴增40個循環(huán)，最后為溶解曲線步驟。采用2-△△Ct方法分析目的基因mRNA的表達水平。④蛋白免疫印跡檢測HUVEC細胞中VCAM-1和ICAM-1的蛋白表達水平：各組經(jīng)裂解提取細胞的總蛋白，用Q5000超微量核酸蛋白測定儀測定所得蛋白濃度。取適量濃度蛋白溶液制樣，樣品經(jīng)5%濃縮膠、10%分離膠SDS-PAGE電泳分離。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（4℃過夜）。室溫下封閉2h（5%脫脂奶粉），與一抗孵育過夜（4℃，搖床）。與辣根過氧化物酶標記的二抗共同孵育2h（室溫，搖床）。用TBST溶液雜交膜充分洗凈后，顯影定影。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，各組間用單因素方差分析及Turkey多重比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度BPA對細胞的抑制作用 溶劑對照組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。除BPA最低濃度組（10-3μmol/L）外，其他濃度（10-2μmol/L，10-1μmol/L，1μmol/L，10μmol/L，102μmol/L，103μmol/L）均對HUVEC有抑制作用，且隨著BP濃度的增加，其抑制作用逐漸增強，細胞活力逐漸下降。見圖1。

圖1 不同濃度BPA 對細胞的抑制作用

2.2 不同濃度BPA對細胞中VCAM-1的mRNA表達的影響 溶劑對照組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。隨著BPA濃度升高，HUVEC細胞中的VCAM-1和ICAM-1mRNA表達量顯著上調(diào)。見圖2、圖3。

圖2 不同濃度BPA 對細胞中VCAM-1的mRNA表達的影響

圖3 不同濃度BPA 對細胞中ICAM-1的mRNA表達的影響

2.3 不同濃度BPA對HUVEC細胞VCAM-1和ICAM-1蛋白表達的影響，溶劑對照組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。隨著BPA濃度升高，HUVEC細胞中的VCAM-1和ICAM-1的蛋白表達量顯著上調(diào)。見圖4～6。

圖4 不同濃度BPA對HUVEC細胞VCAM-1和ICAM-1蛋白表達影響

圖5 不同濃度BPA對HUVEC細胞VCAM-1蛋白表達影響

圖6 濃度BPA對HUVEC細胞VCAM-1蛋白表達的影響

3 討論

BPA在不同國家的多數(shù)人群的血清、尿液、母乳和唾液中均能被檢測到［5］。流行病學(xué)研究表明，尿液或血清中的BPA水平與各種心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)作風險呈正相關(guān)［6］。最近多項研究也表明暴露BPA會增加小鼠的動脈粥樣硬化［7］，并改變小鼠和大鼠的心臟功能［8-10］，提示BPA暴露可能是心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生的一個危險因素。然而關(guān)于BPA如何在細胞水平引起心血管系統(tǒng)疾病尚不清楚。

內(nèi)皮細胞的改變在較多心血管系統(tǒng)疾病的不同發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用，研究表明，內(nèi)皮功能障礙可作為未來心血管事件風險的指標［11］。血管內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化的早期和關(guān)鍵信號，以粘附分子表達增多為表型特征，包括血管細胞粘附分子-1（VCAM-1）和細胞間粘附分子 -1（ICAM-1）［12］。VCAM-1定位于活化的內(nèi)皮細胞表面，被認為是動脈粥樣硬化的關(guān)鍵介質(zhì)。其能與T淋巴細胞和單核細胞表達的因子結(jié)合，促進白細胞的形成［13］。ICAM-1是另一種內(nèi)皮粘附分子，作為白血球和內(nèi)皮細胞跨膜的蛋白質(zhì)，在穩(wěn)定細胞間相互作用和促進白血球、內(nèi)皮細胞的遷移中起到重要作用。研究表明，ICAM-1的水平與人類動脈粥樣硬化的程度相關(guān)，ICAM-1的下調(diào)能夠減輕載脂蛋白缺乏小鼠的血管病變［14］。

近年來，高血壓、糖尿病、冠心病等心血管系統(tǒng)疾病患病率在全球范圍內(nèi)迅速上升［15］。除傳統(tǒng)風險因素外，環(huán)境激素干擾的因素也逐漸引起關(guān)注。研究表明，環(huán)境激素可能通過其在體內(nèi)的分泌、運輸及代謝等活動誘導(dǎo)心血管系統(tǒng)疾病，特別是BPA，已被懷疑是這些疾病潛在病因［16］。BPA是一種合成單體，用于聚碳酸酯塑料和環(huán)氧樹脂的制造，在新生兒、兒童和成人的尿液、血液、唾液、胎盤組織、脂肪組織和母乳中均能被檢測到［17］。關(guān)于BPA的大多數(shù)研究均圍繞其與生殖系統(tǒng)毒性的關(guān)系展開。然而，有關(guān)BPA與心血管系統(tǒng)疾病聯(lián)系的流行病學(xué)研究報告在幾年內(nèi)大量增加，支持BPA在心血管系統(tǒng)疾病中的作用，但缺乏相關(guān)體內(nèi)外實驗，其具體作用機制尚不完全清楚［18-20］。

本研究結(jié)果顯示，BPA干預(yù)組的細胞抑制率均大于空白對照組和溶劑對照組，且呈劑量依賴性，VCAM-1和ICAM-1的mRNA和蛋白表達也顯著增加，提示BPA可能通過影響HUVEC細胞的生長活力及VCAM-1、ICAM-1的表達，參與心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。該結(jié)果可能為明確 BPA 對心血管疾病的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。然而，關(guān)于BPA對HUVEC細胞的深入機制有待進一步研究。已有研究表明，BPA可能對人的原代內(nèi)皮細胞產(chǎn)生直接的促血管生成作用，提示人的內(nèi)皮細胞可能是BPA的重要靶點［21］。內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)及功能完整性對于維持血管穩(wěn)態(tài)有重要作用，內(nèi)皮細胞功能障礙可能導(dǎo)致單核細胞浸潤、脂質(zhì)堆積、斑塊阻塞血管，最后導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生［22］。VCAM-1、ICAM-1是重要的血管細胞粘附分子，參與細胞的識別、活化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細胞的增殖分化、伸展移動［23］。VCAM-1、ICAM-1的激活能夠使血管壁發(fā)生炎性細胞粘附，釋放多種促細胞增殖因子從而促進血管壁細胞增殖及遷移。血管細胞粘附分子所介導(dǎo)的炎癥細胞與血管內(nèi)皮細胞的作用，可能加劇心血管疾病的病理生理過程。研究表明，在心血管疾病中，VCAM-1、ICAM-1的表達升高是內(nèi)皮功能障礙的重要標志［24］。因此，明確BPA對HUVEC細胞中VCAM-1和ICAM-1表達的影響，對于探究其在心血管疾病發(fā)病中的作用十分重要。

綜上所述，BPA能抑制HUVEC細胞的增殖活力，且在分子生物學(xué)水平上發(fā)現(xiàn)BPA能增加HUVEC細胞中VCAM-1和ICAM-1的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平，提示其炎癥在BPA誘導(dǎo)的心血管疾病中具有重要作用，為探索環(huán)境因素對心血管系統(tǒng)發(fā)病的影響提供理論依據(jù)。