抗核抗體對人絨毛膜滋養層細胞系HTR8增殖及凋亡的影響

張莉 吳素琴 郭毅

摘要：目的? 研究抗核抗體對人絨毛膜滋養層細胞系HTR8增殖及凋亡的影響。方法? 體外培養HTR8細胞，使用不同滴度的抗核抗體干預HTR8細胞，分為Control組、抗核抗體低濃度組（滴度1∶100）、抗核抗體高濃度組（滴度≥1∶320）。采用CCK-8法檢測各組細胞增殖水平，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡，Western blot檢測各組細胞bcl-2、bax蛋白表達水平。結果? 抗核抗體高濃度組細胞增殖水平低于Control組，差異有統計學意義（P<0.05）;抗核抗體低濃度組細胞增殖水平與Control組比較，差異無統計學意義（P>0.05）;抗核抗體低濃度組和抗核抗體高濃度組細胞凋亡率均高于Control組，差異有統計學意義（P<0.05）;抗核抗體低濃度組和抗核抗體高濃度組bax表達均高于Control組，bcl-2表達均低于Control組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論? 抗核抗體通過抑制HTR8細胞增殖和促進其凋亡來抑制滋養細胞發育，其有可能影響輔助生殖的結局。

關鍵詞：抗核抗體;滋養細胞;細胞凋亡;細胞增殖;輔助生殖

Abstract：Objective? To study the effect of antinuclear antibody on the proliferation and apoptosis of human chorionic trophoblast cell line HTR8. Methods? HTR8 cells were cultured in vitro， and different titers of antinuclear antibodies were used to intervene in HTR8 cells. They were divided into Control group， antinuclear antibody low concentration group （titer 1：100）， antinuclear antibody high concentration group （titer ≥1：320）. The cell proliferation level of each group was detected by CCK-8 method， the apoptosis of each group was detected by flow cytometry， and the expression levels of bcl-2 and bax protein in each group were detected by Western blot.Results? The cell proliferation level of the anti-nuclear antibody high concentration group was lower than that of the Control group，the difference was statistically significant （P<0.05）; the cell proliferation level of the anti-nuclear antibody low concentration group was not statistically different from the Control group （P>0.05）; Apoptosis was higher in the anti-nuclear antibody low concentration group and the anti-nuclear antibody high concentration group than in the Control group， the difference was statistically significant （P<0.05）; bax expression was high in the anti-nuclear antibody low concentration group and the anti-nuclear antibody high concentration group in the Control group， the expression of bcl-2 was lower than that in the Control group，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? Antinuclear antibodies inhibit the development of trophoblast cells by inhibiting the proliferation of HTR8 cells and promoting their apoptosis， which may affect the outcome of assisted reproduction.

Key words：Antinuclear antibody;Trophoblast;Apoptosis;Cell proliferation;Assisted reproduction

體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization -embryo transplantation，IVF-ET）給不孕不育夫婦帶來了生育的希望。近十年輔助生殖技術發展迅速，但其成功率僅為30%～40%[1，2]。研究發現，IVF-ET成功率與胚胎移植早期滋養細胞的侵蝕能力密切相關，在胚泡埋入子宮內膜植入的過程中，滋養層細胞迅速增殖，細胞滋養層融入合體滋養層完成了胚胎的植入過程，滋養細胞對胎兒的生長和發育起了重要的作用[3]。近來生殖免疫學研究表明，免疫系統失衡是導致移植失敗或流產的重要因素。抗核抗體譜（antinuclear antibody，ANA）包括一系列針對細胞核中抗原成分的自身抗體[4]，前期研究顯示ANA陽性的輔助生殖助孕患者其成功率較低，在風濕免疫科一些患者首發癥狀是妊娠丟失，而目前關于ANA和妊娠的相關性研究較少而且有爭議。因此本研究主要觀察ANA對細胞滋養細胞發育能力的作用，旨在明確ANA對于輔助生殖的結局影響，現報道如下。

1材料與方法

1.1細胞及試劑? 人HTR8細胞購于上海富衡生物科技有限公司，胎牛血清購自Excell bio;DMEM/F12培養基購自Transgen Biotech公司;胰蛋白酶購自HyClone公司;凋亡試劑盒購自Biolegend;CCK-8購自Solarbio試劑有限公司;Anti-Bcl-2，Anti-Bax購自Bioss。將人HTR8細胞置于37℃5%的CO2培養箱中，10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素雙抗DMEM/F12培養基培養，每天換液，隔日傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2 CCK8檢測抗核抗體對HTR8細胞的增殖作用? 將HTR8細胞加入96孔培養板，每孔100 μl（5×103/孔），分組如下：①Control組;②抗核抗體低濃度組（滴度1∶100）;③抗核抗體高濃度組（滴度≥1∶320）。培養24 h后，每孔加入10 μl CCK-8，37℃ 5%CO2培養箱中孵育4 h，酶標儀（上海三科儀器有限公司318C）測定450 nm處的吸光度。

1.3流式細胞術檢測抗核抗體對HTR8細胞的凋亡作用? 將濃度1×105/ml細胞接種于6孔培養板，分組同“1.2”，干預24 h后，收集各孔細胞，包括培養上清中的細胞，PBS洗滌，調節濃度為1×106/ml，將100 μl細胞懸液加入流式管，加5 μl FITC-Annexin V和10 μl PI，室溫避光孵育15 min，加400 μl Cell Staining Buffer，流式細胞儀（Beckman CytoFlex）檢測各組細胞凋亡。

1.4 Western blot檢測抗核抗體對HTR8細胞bax、bcl-2表達的作用? HTR8細胞培養及分組同“1.2”，干預24 h后提取各組細胞總蛋白。采用考馬斯亮藍法對總蛋白濃度進行測定，蛋白上樣量定為30 μg/孔，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉至PVDF膜，一抗（1∶1000）4 ℃孵育過夜，二抗（1∶2000）室溫孵育1 h，洗膜后置于凝膠成像分析系統采集圖像，以目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值的比值作為蛋白表達。

1.5統計學處理? 數據采用SPSS 16.0和Graphad8.0軟件進行分析和作圖，計量資料以（x±s）表示，各組之間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2結果

2.1抗核抗體對HTR8細胞的增殖作用? CCK8檢測顯示，抗核抗體高濃度組細胞增殖活性低于Control組，差異有統計學意義（P<0.05）;抗核抗體低濃度組細胞增殖活性與Control組比較，差異無統計學意義（P>0.05），見圖1。

2.2抗核抗體對HTR8細胞的凋亡作用? 流式細胞術檢測結果顯示，抗核抗體低濃度組和高濃度組細胞凋亡率均高于Control組，差異有統計學意義（P<0.05），見圖2。

2.3抗核抗體對HTR8細胞bax、bcl-2表達的作用? 抗核抗體低濃度組和高濃度組bax表達均高于Control組，bcl-2表達均低于Control組，差異有統計學意義（P<0.05），見圖3。

3討論

不孕癥指夫妻有正常性生活、未采取任何避孕措施而未孕達1年及以上，其發病率呈明顯上升的趨勢。全世界的不孕患者人數約為8000萬～1.1億。不孕癥發病率的遞增趨勢可能與排卵障礙、精液質量下降、人工流產、性傳播疾病等相關[5]。IVF-ET的成功與否和多種因素有關，如年齡、BMI、染色體、卵巢儲備能力、解剖異常、不孕年限、內分泌、免疫因素和男性精子質量等。自身免疫異常產生的自身抗體和生育能力下降密切相關[6，7]，而且自身抗體與IVF-ET的移植失敗或流產也密切相關，常見的自身抗體包括抗磷脂抗體、抗核抗體、抗甲狀腺抗體等[8，9]。

抗核抗體代表了對細胞核內三大類抗原物質（DNA、組蛋白及非組蛋白）起反應的各種自身抗體[4]，在系統性紅斑狼瘡、干燥綜合征和其他結締組織病均有ANA表達，ANA陽性也在相當比例的健康人群中存在[10]。目前國內外關于ANA與IVF-ET結局相關性的研究較少，其相關性尚存在爭議。國外有研究報道，復發性流產患者中ANA的陽性率為13.21%[11]，ANA患者接受IVF-ET技術后懷孕率降低，同時ANA還會降低首次IVF-ET的受孕率，而經過強的松和低劑量的阿司匹林治療后，IVF-ET成功率顯著提高[12]。國內研究顯示，在ANAs中抗Scl-70和抗PM-Scl抗體陽性降低了IVF-ET的懷孕率，抗Rib P、抗Jo-1和抗dsDNA抗體陽性則大大增加了IVF-ET的早期流產率[13]。抗Scl-70抗體還能抵抗早期的胚胎發育，其原因被認為是抗Scl-70損害了在胚胎早期發育中起關鍵作用的DNA拓撲異構酶[14]。但目前對于ANA與IVF-ET結局相關性的研究僅限于臨床資料分析。

自身抗體可能通過不同的機制造成滋養細胞發育障礙、胎盤部位血栓形成，從而導致胚胎丟失[15]。自身抗體還可能阻止RNA的轉錄，引起DNA復制障礙導致胚胎丟失，有研究顯示ANA可能干擾細胞分裂過程導致胚胎丟失[16]。目前抗磷脂抗體綜合征導致胚胎丟失的機制研究基本已經明確：抗磷脂抗體能通過激活補體、引起消耗性血小板減少等機制引起滋養細胞發育障礙，進而引起母胎交界處胎盤發育不良導致胎盤血栓形成，抗磷脂抗體也降低了IVF的成功率，而通過強的松和小劑量阿司匹林的治療明顯提高了IVF的成功率[17，18]。有研究指出，抗磷脂抗體能增加滋養細胞的凋亡，影響滋養細胞發育而導致妊娠丟失[19]，而肝素和阿司匹林能夠增加滋養細胞bcl-2的表達，恢復增殖和分化，增加滋養細胞的活力[20]。因此本研究推測抗核抗體對滋養細胞凋亡和增殖的影響對于IVF-ET后胚胎植入和發育起著重要的作用，本次研究結果顯示，抗核抗體高濃度組細胞增殖水平低于Control組，而抗核抗體低濃度組細胞增殖水平與Control組比較基本一致;且抗核抗體低濃度組和抗核抗體高濃度組細胞凋亡率均高于Control組， bax表達均高于Control組，bcl-2表達均低于Control組，差異有統計學意義（P<0.05）。說明ANA干預滋養細胞后，滋養細胞增殖能力下降，凋亡率增加，而ANA可以促使凋亡bax表達，降低了抗凋亡bcl-2表達，具有抑制滋養細胞增殖，促進其凋亡的作用，通過抑制滋養細胞發育影響IVF-ET結局。

綜上所述，抗核抗體通過抑制滋養細胞增殖和促進其凋亡而降低輔助生殖的結局。在生殖科采用IVF-ET技術的患者大多是高齡或長期不孕患者，面臨卵巢儲備下降的風險，而且IVF-ET費用不菲，IVF-ET失敗對于患者身體、家庭、經濟都是沉重的打擊。今后需尋找逆轉抗核抗體作用的藥物，扭轉助孕患者免疫失衡，尋求提高ANA陽性患者IVF-ET妊娠成功率的方法。

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收稿日期：2020-04-07;修回日期：2020-04-20

編輯/成森