孤兒核受體Nur77/NR4A1調節巨噬細胞炎癥反應研究進展

蔣玉潔 羅維貴 廖品琥

[專家介紹]廖品琥，教授、主任醫師，英國帝國理工大學醫學博士，博士生導師，廣西醫學會會長，廣西醫師協會副會長，中國醫院管理學會常務理事，廣西醫學會重癥醫學分會副主任委員，暨南大學臨床醫學專業學位教育指導委員會委員，現任廣西壯族自治區衛生健康委員會黨組書記、主任。曾在英國帝國理工大學皇家布朗普頓醫院（Royal Brompton Hospital）從事博士后研究。研究方向為急危重癥分子免疫機制。任多家醫學雜志的主編、副主編及編委，主持國家自然科學基金4項、廣西科技廳攻關項目2項，廣西教育廳、廣西衛生廳重點科研項目各1項。醫學論文《Ventilatorassociated lung injury》發表于國際著名期刊《Lancet》，學術觀點被歐美學者廣泛引用。共發表學術論文100余篇，其中SCI收錄23篇，出版專著及教材8部，曾獲廣西科技進步二、三等獎，廣西“十百千人才工程”第二層次人選。

【摘要】巨噬細胞作為抵御病原體入侵的第一道防線，在固有免疫和適應性免疫中均發揮不可或缺的作用。孤兒核受體是一類目前尚未發現天然配體的核受體，Nur77/NR4A1是其NR4A亞家族中的成員之一，廣泛表達于各組織、器官，通過轉錄及非轉錄調節作用，參與細胞炎癥反應、增殖、分化、凋亡、自噬、代謝等過程。近期研究發現，Nur77/NR4A1參與巨噬細胞多種功能的調控。對Nur77/NR4A1在巨噬細胞炎癥反應中的作用及機制進行綜述，有助于更好地了解巨噬細胞相關炎癥性疾病的分子機制。

【關鍵詞】孤兒核受體;Nur77;NR4A1;巨噬細胞;炎癥反應

中圖分類號：R363文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2020.06.001

【Abstract】 ?As the first line of defense fighting against pathogen invasion，macrophages play an indispensable role in innate and adaptive immunity.Orphan nuclear receptor is a kind of nuclear receptor whose natural ligand has not been found yet.Nur77/NR4A1 is a member of NR4A subfamily，which is widely expressed in various tissues and organs.Through transcriptional and non transcriptional regulation，Nur77/NR4A1 participates in the process of cell inflammation，proliferation，differentiation，apoptosis，autophagy，metabolism，etc.Recent studies revealed that Nur77/NR4A1 involves in the regulation of multiple functions of macrophages.Herein，we review the role of Nur77/NR4A1 in macrophagemediated inflammation，which is helpful to achieve a better understanding of the cellular and molecular mechanisms of macrophagemediated inflammatory diseases.

【Key words】orphan nuclear receptor;Nur77;NR4A1; macrophage;inflammatory response

有關巨噬細胞的研究雖然已跨越百年，但其在維持內環境穩定和疾病中的作用仍未完全闡明[1]。巨噬細胞作為對抗病原體入侵的第一道防線，是機體免疫系統中必不可少的組成部分。然而，在一些急慢性炎癥性疾病中，巨噬細胞炎癥反應持續時間過長或反應過度將導致局部內環境失穩態，加重組織損傷。因此，抑制過度的巨噬細胞炎癥反應或可成為巨噬細胞介導的急慢性炎癥性疾病的治療新靶標[2]。孤兒核受體是一類目前尚未發現天然配體的核受體，Nur77/NR4A1是其NR4A亞家族中的成員之一，廣泛表達于各組織、器官，通過轉錄及非轉錄調節作用，參與細胞炎癥反應、增殖、分化、凋亡、自噬、代謝等過程。核受體亞家族4 A組（Nuclear Receptor Subfamily 4 Group A，NR4A）包括成員1（Nur77/NR4A1）、成員2（Nurr1/NR4A2）及成員3（Nor1/NR4A3）。Nur77/NR4A1作為核因子，既可是轉錄激活因子，亦可是轉錄抑制因子，這取決于其招募的共調節因子和翻譯后修飾[3]。除了通過轉錄調節作用于靶基因之外，Nur77還可通過與線粒體結合等非轉錄調節作用參與多種生物學過程[4]。Nur77/NR4A1可在脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factorα，TNFα）、氧化型低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoprotein，oxLDL）等刺激物的作用下表達于多種巨噬細胞中，調節巨噬細胞炎癥反應[5]、極化[6]、吞噬作用[7]、凋亡[8]、線粒體代謝[5]、脂質沉積[9]、細胞外基質重塑[10]、免疫耐受[10]以及在腸道黏膜血管周圍的定位[11]等功能。Nur77/NR4A1在巨噬細胞中的作用可因細胞類型及刺激物的不同而各異，既可抑制巨噬細胞炎癥反應，亦可促進巨噬細胞炎癥反應，表現出多變而多效的生物學效應。現對Nur77/NR4A1在巨噬細胞炎癥反應中的作用及機制進行綜述，以便更好地了解巨噬細胞相關炎癥性疾病的分子機制。

1Nur77/NR4A1結構特點

Nur77/NR4A1由定位于人12號染色體的立早基因Nur77，又名NR4A1、NGFIB、TR3、NAK1、GFRP1、HMR、N10、NP10編碼。Nur77/NR4A1蛋白由598個氨基酸組成，包含A/B、C、D、E 5個結構域。A/B區為包含非配體依賴轉錄激活區（activation function，AF）1的N端轉錄激活結構域（transactivation domain，TAD）;C區位于中央區，為高度保守的鋅指DNA結合結構域（DNA binding domain，DBD）;D區為可增加靈活性的鉸鏈區;E區為包含AF2的C端配體結合結構域（ligand binding domain，LBD）[12]。REHMAN等[13]在小鼠中鑒定出兩種缺乏TAD的Nur77/NR4A1蛋白亞型，這些亞型主要定位于細胞核外，提示在Nur77/NR4A1從細胞核轉移至細胞質的過程中TAD或許是必需的。DBD可特異性識別靶基因啟動子上的NGFIB反應元件（NGFIB response element，NBRE，序列為AAAGGTCA），以單體或同源二聚體的形式與NBRE結合從而調節這些靶基因的表達水平。Nur77/NR4A1亦可以異源二聚體的形式與Nur反應元件[序列：AAT（G/A）（C/T）CA]相結合。除此之外，Nur77/NR4A1還可以通過與視黃醇X受體形成異源二聚體與靶基因上的DR5反應元件（序列：AGGTCANNNAAAGGTCA，N為任意單核苷酸）結合來調控靶基因的轉錄[14]。LBD為數個疏水氨基酸殘基形成的配體結合口袋，包含一個配體依賴的AF2轉錄激活結構域，目前尚未發現其內源性配體[12]。

2Nur77/NR4A1在巨噬細胞中的表達

在正常生理狀態下，Nur77/NR4A1低表達或不表達于巨噬細胞，而在多種刺激物的作用下，可高表達于各種類型巨噬細胞，發揮多效調節作用。腹腔巨噬細胞（peritoneal macrophage，PM）在大腸桿菌刺激后Nur77 mRNA表達水平隨著時間的推移而升高，在4小時達到頂峰后逐漸下降[15];同樣，PM在Kdo lipid A刺激2小時后Nur77 mRNA表達水平亦顯著升高[16]。VARGA等[17]采用基因芯片檢測小鼠脛前肌炎癥組織中Ly6C+ F4/80low和 LyC6 F4/80high巨噬細胞基因表達譜，結果發現Nur77/NR4A1在兩種巨噬細胞亞群中均呈現高表達。小鼠骨髓來源巨噬細胞（bone marrow derived macrophage，BMM）[18]及血Ly6C+單核細胞[16]在LPS刺激后Nur77 mRNA表達水平均較刺激前明顯升高。分別使用LPS及TNFα刺激人血循環原代巨噬細胞及佛波酯誘導THP1來源的巨噬細胞，亦可誘導Nur77 mRNA高表達[19]。oxLDL刺激則可通過激活p38MAPK信號通路誘導RAW264.7巨噬細胞高表達Nur77/NR4A1[8]。使用LPS+zVAD刺激RAW264.7巨噬細胞，與對照組及單獨使用LPS或zVAD刺激相比，可誘導Nur77 mRNA及蛋白表達水平顯著升高，且該作用依賴于MEF2活性及ERK信號轉導通路，Nap為其中主要靶標[20]。BONTA等[19]對來自8名器官捐獻者的主動脈進行原位雜交和免疫組化檢測，結果顯示主動脈粥樣硬化病灶處巨噬細胞Nur77 mRNA及蛋白水平呈高表達，且定位于細胞核中。

3Nur77/NR4A1與巨噬細胞炎癥反應

Nur77/NR4A1在巨噬細胞炎癥反應中的作用是細胞類型及刺激物依賴的，不同種類的巨噬細胞在不同的刺激物作用下，可發揮抗炎、促炎作用，亦可能毫無作用。

3.1Nur77/NR4A1減輕巨噬細胞炎癥反應使用微陣列芯片對Nur77/BMM和野生型BMM進行轉錄譜測繪，IPA通路分析發現炎癥反應、細胞間信號傳導及相互作用、血液系統發育、細胞移動和免疫細胞遷移在Nur77/BMM中激活，提示在Nur77/BMM中炎癥反應增強[10]。HAMERS等[18]發現Nur77/BMM 在LPS刺激后白介素（Interlukin，IL）12、干擾素（Interferon，INF）γ較野生型BMM顯著升高，而IL6、IL1β表達水平在野生型BMM中升高更為明顯，單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein1，MCP1）與TNFα在野生型與Nur77/BMM中表達無顯著差異。HU等[21]發現RAW2647巨噬細胞、Nur77 DBD或TAD缺陷RAW264.7細胞經oxLDL刺激后炎癥因子TNFα及IL12蛋白表達水平均明顯升高，而Nur77過表達則反之。提示Nur77/NR4A1可抑制oxLDL誘導的巨噬細胞炎癥反應，且此作用依賴于其轉錄活性。而在oxLDL刺激的THP1巨噬細胞中，過表達Nur77或使用Nur77激動劑CsnB均可上調轉化生長因子β（transforming growth factorβ，TGFβ）、CD40 mRNA表達水平，下調IL1β、IL6、IL12、TNFα、C反應蛋白（C reactive protein，CRP）、細胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule1，ICAM1）、核因子NFκB（nuclear factor kappaB，NFκB）mRNA表達水平;過表達Nur77可下調血管細胞黏附分子（Vascular Cell Adhesion Molecule1，VCAM1）表達，Nur77敲減則上調其表達，CsnB預處理對VCAM1表達水平無明顯影響[9]。LPS或TNFα刺激人血循環原代巨噬細胞及佛波酯誘導THP1來源的巨噬細胞后，炎癥因子IL1β、IL8、MIP1α/β、MCP1表達水平顯著上升，而過表達Nur77可使上述因子表達水平下降，Nur77敲減則增加LPS誘導的THP1 IL1β、IL8、MCP1表達水平[19]。以上結果均提示Nur77/NR4A1在多種巨噬細胞炎癥模型中均具有抗炎癥作用。

3.2Nur77/NR4A1促進巨噬細胞炎癥反應PEI等[22]使用基因芯片對過表達Nur77的RAW264.7巨噬細胞及空載體RAW264.7巨噬細胞進行轉錄組學分析，結果提示表達差異最為顯著的基因涉及炎癥信號轉導通路（MARCKS、NIK、Ikki/Ikk∈）、細胞周期調控（cyclin D2）及凋亡（cathepsin E）。使用real time PCR對轉錄組學結果進行驗證，發現Nur77過表達RAW264.7細胞富含丙氨酸的豆蔻酰化蛋白激酶C的作用底物（myristoylated alaninerich C kinase substrate，MARCKS）、NFκB誘導激酶（NFκBinducing kinase，NIK）、IκB 激酶（INFκB kinase，IKK） i/IKK∈、cyclin D2、cathepsin E mRNA表達水平均高于空載體組細胞。為除外細胞特異性所導致的表達水平改變，作者隨后使用了J774A.1 巨噬細胞進行驗證，Nur77過表達J774A.1巨噬細胞MARCKS、NIK、IKKi/IKK∈、cyclin D2、cyclin E2、cathepsin E mRNA表達水平均高于空載體組J774A.1細胞[22]。對小鼠IKKi基因啟動子進行DNA序列分析，發現在其近端420bp處存在一個潛在NBRE。凝膠遷移實驗顯示Nur77可與IKKi的NBRE結合，而無法與突變的NBRE結合。將包含IKKi啟動子1107 bp至+22bp的熒光素酶報告基因與表達Nur77的質粒共轉染至RAW264.7細胞中，結果提示Nur77可激活IKKi啟動子，而NBRE突變則降低RAW264.7細胞對Nur77過表達及LPS的反應。說明Nur77/NR4A1可與IKKi啟動子中的NBRE直接結合而調控IKKi的表達。而分別使用LPS及PolyI：C刺激RAW264.7細胞，結果顯示Nur77過表達組細胞MARCKS、MX1、TNFα、IP10及cyclin D2表達水平均高于空載體組。這提示在TLR3及TLR4配體活化的巨噬細胞中，Nur77/NR4A1通過與IKKi直接結合，發揮促炎介質的作用[22]。

3.3Nur77/NR4A1對巨噬細胞炎癥無調節作用HAMERS等[15]分離野生型小鼠與Nur77/小鼠PM進行體外培養，觀察大腸桿菌刺激后炎癥因子TNFα、IL6、IL1β，趨化因子MCP1、RANTES、MIP2，以及TLR抑制因子SOCS1、A20及IRAKM mRNA表達水平的變化。結果顯示，上述因子在野生型與Nur77/ PM的表達無顯著差異。提示Nur77/NR4A1在PM應對大腸桿菌感染的炎癥反應中并未發揮作用。CHAO等[6]發現野生型與Nur77/BMM在LPS刺激后IL6、IL2b、iNOS及TNFα mRNA表達水平均明顯升高，但兩者之間差異無統計學意義，同樣的結果亦出現于巰基乙酸鹽誘導的PM，提示Nur77/NR4A1對LPS刺激的BMM和PM炎癥反應無調節作用。

3.4Nur77/NR4A1調節巨噬細胞炎癥反應的機制 （1）調控NFκB信號通路介導的巨噬細胞炎癥反應。在LPS刺激的RAW264.7細胞中過表達Nur77可通過抑制NFκB信號通路下調促炎因子TNFα和MIF1、趨化因子MCP1 mRNA表達，上調保護性細胞因子IL10 mRNA表達，而對IL6和KC mRNA表達無影響[23]。Nur77/小鼠PM經KLA刺激后，IL12、iNOS、磷酸化p65 NFκB表達水平均顯著高于野生型小鼠PM;而使用NFκB抑制劑BAY117082預處理則可通過阻斷p65 NFκB磷酸化降低LPS誘導的炎癥反應。提示Nur77/NR4A1缺陷可通過調控NFκB信號轉導通路促進LPS誘導的PM炎癥反應[16]。如前所述，Nur77/NR4A1可通過與IKKi直接結合，而調控巨噬細胞炎癥反應。（2）調節巨噬細胞線粒體代謝重編程。DUCO等[5]采用ChIPseq及RNAseq方法對高表達Nur77的RAW264.7巨噬細胞進行了全基因組結合位點以及轉錄組學檢測，使用BETA軟件包將ChIPseq和RNAseq數據聯系起來以識別Nur77直接調控的基因并進行信號通路分析。結果發現，在上調基因中匹配上532個Nur77結合位點，主要涉及溶酶體、免疫系統、脂質/脂蛋白代謝、糖代謝及分枝桿菌感染，在下調基因中連接上649個結合位點，主要涉及免疫系統、細胞因子信號通路、干擾素信號通路、適應性免疫系統、直接p53效應因子。隨后作者對Nur77/NR4A1在線粒體代謝中的作用進行了系列研究。首先，Nur77/BMM線粒體數量較野生型顯著減少，且可觀察到較野生型更為廣泛的溶酶體與線粒體共定位，提示Nur77/NR4A1敲除可增加BMM線粒體自噬。在LPS刺激前后，Nur77/BMM相對野生型BMM而言均高表達線粒體異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）亞型（Idh2，Idh3b，Idh3g），而細胞質IDH（Idh1）及其他三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環酶基因則很大程度上無變化，Nur77過表達則表現出相反的結果，提示Nur77/NR4A1下調線粒體IDH亞型。其次，代謝組學分析提示，在LPS刺激后，與野生型BMM相比Nur77/BMM表達更高的α酮戊二酸及TCA循環下游中間產物，而產生較少的乳酸，異檸檬酸/α酮戊二酸比值更低，這提示IDH除亞型變化外還出現活性增加。Nur77/BMM在LPS刺激后NADH/NAD+ 增加，2羥戊二酸水平增加，進一步證實Nur77/NR4A1敲除可導致LPS誘導的BMM TCA循環活性增加及促炎代謝產物生成增多。最后，Nur77/NR4A1敲除可增加LPS誘導的BMM及RAW264.7細胞琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）介導的線粒體呼吸，增加LPS誘導的BMM的SDH活性。SDH促進線粒體活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生增加亦可使促炎轉錄因子低氧誘導因子α（hypoxia inducible factorα，HIFα）穩定性增加。線粒體ROS主要由電子傳遞鏈（electron transport train，ETC）的復合體I產生，復合體I將CTA循環衍生NADH氧化與輔酶Q偶聯。使用△ψm insensitive Mito Tracker Green FM和△ψm sensitive Mito Tracker Red CMH2 Xros進行流式細胞學檢測，結果提示更多的Nur77/BMM出現線粒體超極化，Nur77/BMM及RAW264.7細胞在LPS刺激后較野生型產生更高水平的ROS（線粒體及全細胞）及HIFα。這些結果提示Nur77/NR4A1敲除使LPS刺激的BMM線粒體膜超極化增加，ROS生成增多，SDH介導的HIFα穩定性增加。在促炎巨噬細胞中，SDH介導的HIFα穩定可導致除TNFα以外的炎癥因子產生增加。RNAseq提示，Nur77敲除BMM表達更高水平的SDH調節的促炎因子基因，包括IL1b、IL6、IL12a、IL12b及IL18，抗炎因子IL10下調，而促炎因子基因Tnf無改變。在Nur77敲除BMM中過表達Nur77則導致IL1b、IL6基因表達水平下降，Tnf則無變化。相應地，LPS刺激的Nur77敲除BMM中IL6、IL12p70和IL1β蛋白表達水平升高，IL10表達水平下降，TNFα則無改變。LPS刺激的Nur77敲除BMM高表達琥珀酸受體Sucnr1（GPR91）及促炎因子IL18及IFNγ，野生型BMM則無。結合前述，提示Nur77/NR4A1敲除BMM的SDH活性增加，導致LPS刺激后Nur77/BMM促炎因子產生增多。

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（收稿日期：2020-05-05修回日期：2020-05-12）

（編輯：梁明佩）