超聲波輔助生物酶提取紫薯色素工藝優化

東子珺 徐曉萍

摘? ? 要：紫薯色素原料易得、造價低廉且具有抗癌、抗氧化和預防疾病等功效，因此紫薯色素提取成為科研者的重點研究對象。本文通過結合目前常見的超聲波提取法、生物酶提取法，進一步優化紫薯色素提取工藝。通過單因素試驗和正交試驗得到在實驗范圍內最佳提取工藝為：采用超聲波-半纖維素生物酶協同提取紫薯色素效果佳，其中酶用量25 U·mL-1、超聲時間20 min、溫度60 ℃、溶液pH值為4.0、料液比1∶25，得到色素提取量為31.72 mg·（100 g）-1;影響色素提取因素大小為：pH值>酶用量>超聲時間。本文為紫薯色素的實際生產和開發利用提供一定的理論依據。

關鍵詞：紫薯色素;超聲波;半纖維素酶;提取

Abstract： The raw material of purple potato pigment is easy to be obtained. It has inexpensive price and many effects， such as anti-cancer， anti-oxidation and prevention of disease. Therefore， the extraction of purple potato pigment has become the focus of research. In this paper， the extraction process of purple sweet potato pigment was further optimized by combining the ultrasonic extraction method and biological enzyme extraction method. According to single factor test and orthogonal test， the optimal extraction process within the experimental range was as follows： the ultrasonic and hemicellulose enzyme were used to extract the pigment of purple sweet potato with the best effect. The enzyme dosage was 25 U·mL-1， the ultrasonic time was 20 minutes， the temperature was 60 ℃， the pH was 4.0， the solid-liquid ratio was 1∶25， and the extraction amount of pigment was 31.72 mg·（100 g）-1. The order of the factors affecting the extraction of purple potato pigment was： pH > enzyme dosage > ultrasonic time. It provided some theoretical basis for the actual production， development and utilization of purple sweet potato pigment.

Key words： purple potato pigment; ultrasonic; hemicellulose; extraction

紫薯色素主要成分為花青素。花青素具有抗氧化、抗癌、預防疾病[1]等功效，常作為食品調色原料，是人類飲食的重要組成部分[2]。自然界中鮮有單純的花青素存在，在紫薯色素中的花青素主要為矢車菊素、芍藥色素和極少量的天竺葵色素，都是以糖苷化后的酰基化衍生物的形式存在[3]，因此，紫薯色素穩定性強[4]，抗氧化效果好[5]。

色素提取常見方法有溶劑萃取法[6]、超聲波提取法[7]、生物酶提取法[8]等。其中溶劑萃取法操作簡便，但提取率低、溶劑使用量大[9]。超聲波提取法利用振動和空化效應[10]來破壞細胞，具有提取時間短、操作簡單、提取率高等特點[11]。生物酶提取法是通過對植物細胞相關物質進行降解從而提取出色素，具有高效性、專一性[12]，但成本較高。

綜上所述，結合各個方法的優缺點，本文將采用超聲波-生物酶協同提取法，并以檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液作為提取劑，研究紫薯色素的最佳提取工藝，為紫薯色素提取提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

紫薯（購于市場）;檸檬酸（天津市風船化學試劑科技有限公司 分析純）;檸檬酸鈉（天津市北方天醫化學試劑廠 分析純）;半纖維素酶（源葉生物 20 000 U·g-1）;α-淀粉酶（北京奧博星生物技術有限責任公司 ≥3 700 U·g-1）;纖維素酶（麥克林 10 000 U·g-1）;檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH值3.2，4.0，4.8）;酶液（5 U·mL）。

1.2 儀器與設備

遠紅外干燥箱（220 V，50 Hz，1.2 kW）? ?天津市天宇實驗儀器有限公司;HD-600超聲儀（220 V/50 Hz，600 W，40 kHz）? ?濟寧亨達超聲設備有限公司;JW-3021HR高速冷凍離心機? ?安徽嘉文儀器裝備設備有限公司;722S可見分光光度計? ?上海菁華科技儀器設備有限公司;恒溫水浴鍋? ?北京中興偉業儀器有限公司;多功能粉碎機? ?佛山德瑪仕網絡科技有限公司;FA1204B電子天平? ?上海精密科學儀器;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計? ?北京普析通用有限責任公司;FTIR-650傅立葉變換紅外光譜儀? ?天津港東科技發展股份有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 紫薯粉的制備 紫薯粉的制備工藝：選擇無病變或無腐爛的新鮮紫薯，洗去表面的沉積物，將其（生紫薯或熟紫薯）放入遠紅外干燥箱中在不同溫度下進行干燥，取出后用粉碎機粉碎，過篩，避光保存。

1.3.2 色素提取流程 本文主要通過超聲波-生物酶協同提取法對紫薯色素進行提取，并與超聲法和酶解法進行對比。同時，在文獻[13]中發現酶解溫度曲線較為平緩，由此推斷酶解溫度對紫薯色素提取的影響不大，因此本文選用酶解溫度為50 ℃[13]。

超聲波-生物酶協同提取法操作過程為：用分析天平精確稱取紫薯粉置于大試管中;加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液、酶，密封后水浴加熱，再進行超聲、離心，取上清液定容至50 mL容量瓶中，并測定吸光度。

酶解法無需超聲，其余流程同超聲波-生物酶協同提取法。

超聲法無需酶解，其余流程同超聲波-生物酶協同提取法。

1.3.3 紫薯總色素含量計算方法 總色素含量參照文獻[14]提供的公式進行計算。

式中：M—總色素含量/（mg·（100 g）-1），A—吸光度，N—稀釋倍數，X—浸提液體積/mL，m—原料質量/g，98.2—消光系數。

1.3.4 紫薯中花青素的初步判斷 為確保所提取色素為花青素，本文采用紫外-可見分光光度法[15]和紅外光譜法[16]對色素進行初步判斷。

1.3.5 最大吸收波長測定 稱取3種紫薯粉各1.000 0 g置于大試管中;加入pH值4.8檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液20 mL，將其密封之后置于50 ℃水浴鍋中水浴1 h，取出放至室溫;轉移至50 mL離心管中，以3 000 r·min-1的轉速離心15 min;取上清液，用pH值4.8檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液定容至50 mL的容量瓶中;通過紫外-可見分光光度計全波掃描，確定最大吸收波長。

1.3.6 單因素試驗 按照1.3.2超聲波-生物酶協同提取法提取流程以及設計的單因素試驗條件展開試驗（表1）。研究一種因素的影響時，其余各因素均恒定，并且均采用上一試驗的最佳值開展下一項試驗。

2 結果與分析

2.1 紫薯粉的選擇

通過圖1可見，生紫薯直接置于烘干箱烘干，紫薯粉末會發生褐變現象，且隨著溫度升高，褐變現象明顯。這是由于生紫薯粉中淀粉難溶于水，隨著溫度的升高，淀粉分子發生劇烈振動，造成氫鍵斷裂，發生糊化，產生不同程度的褐變反應;而熟紫薯由于在蒸熟過程中改變紫薯細胞膜的通透性，同時使花青素的多酚含量增加[17]，發生輔色效應，提高花青素的穩定性[18]。因此，即使在70 ℃溫度條件下也不會出現褐變現象。此外，據研究表明花青素于120 ℃時降解率最高[19]。綜合考慮，選用熟紫薯粉進行研究。

2.2 紫薯中花青素的初步判斷

2.2.1 紫外-可見分光光度法對紫薯色素的初步判斷 通過將定容后的紫薯色素溶液置于紫外-可見分光光度計中進行掃描，并與花青素標準溶液的紫外-可見吸收光譜[15]進行對比，初步判斷提取的紫薯色素是花青素。由圖2可知，提取出的色素稀溶液在可見光區540 nm附近和紫外光區297 nm、324 nm附近有吸收峰，并且紫薯色素主要在紫外光區有強吸收，說明紫薯色素存在共軛體系。但紫外主要是針對無顏色的稀溶液，而提取出的色素是有顏色的濃溶液，因此不適合在紫外進行評測。通過對提取出的濃色素溶液在可見光區進行掃描，測定最大吸收波長為540 nm（圖3）。與文獻[15]中標準溶液紫外-可見吸收光譜圖進行對比，所提取的色素與標準溶液的紫外-可見吸收光譜圖[15]吸收峰位置大致一致。周培劍[20]在對紫薯色素的提取研究中得出在可見光最大吸收波長為530 nm，與本試驗結果相近，初步判斷提取出的色素為花青素。此外，由于在紫外光區324 nm附近有吸收峰，可以判斷提取出的花青素存在酰基化[21]，具有更高的穩定性[22]。因此，從紫薯中提取出的花青素更有適用性。

2.2.2 紅外光譜法對紫薯色素的初步判斷 將提取的紫薯色素溶液在紅外光譜儀中進行掃描，如圖4所示，并與郭燕等[16]所得標準溶液紅外光譜圖進行對比。通過圖4與標準溶液紅外光譜圖[16]的對比，發現提取出的花青素與標準溶液的紅外光譜圖[16]出峰位置相似。在3 500～3 200 cm-1附近的吸收峰是-OH;在1 650.77 cm-1處的吸收峰是酰基化產物C=O;在1 417.42 cm-1處的吸收峰是苯環和雜環上C-C;在1 274.72 cm-1和1 089.58 cm-1處的吸收峰是甲氧基。這些吸收峰表現出酰基化花青素中官能團的特征。這一結論與佀俊茹等[23]在研究中的結論相似。因此，初步推斷提取出的色素為花青素。

2.3 單因素試驗分析

2.3.1 超聲溫度對紫薯色素的影響 由圖5看出在30 ℃到60 ℃時，吸光度值隨超聲溫度的升高而增大;在60 ℃之后出現下降趨勢，這是因為在30 ℃到60 ℃時，超聲溫度對紫薯細胞破壞力增強，使色素流出;而當溫度上升到一定值時，由于天然色素的熱不穩定性[24]，使色素提取率降低。彭常安等[25]在研究中表明紫薯色素耐溫在60 ℃及以下。如繼續升溫會破壞色素，降低色素的穩定性[26]，從而降低色素提取率。因此，判斷最佳超聲溫度為60 ℃。

2.3.2 超聲時間對紫薯色素提取的影響 由圖6可看出在10～15 min時沒有明顯變化;在15～20 min時吸光度值變大;20 min之后呈現下降趨勢。這是因為在10～15 min時對于紫薯細胞的穿透能力不是很大，使色素流出量較小;而20 min之后隨著時間增加，色素加熱時間也隨之增加，破壞色素而導致。關晴月和鄒宇[27]在研究中得出超聲最佳時間為20 min，與本試驗結果大致一致，因此初步判斷最佳超聲時間為20 min。

2.3.3 酶的種類對紫薯色素提取的影響 由于目前還未有人使用半纖維素酶對紫薯色素提取展開過研究，只有陳合等[28]使用半纖維素酶對姜黃素進行提取，并得到較好的結果。由此提出設想：使用半纖維素酶提取紫薯色素會提高提取率。為驗證該設想，選取半纖維素酶、纖維素酶和α-淀粉酶分別對紫薯色素進行提取。

如圖7可知，半纖維素酶提取紫薯色素為最佳，因為半纖維素酶提取所得的色素含量要高于纖維素酶和α-淀粉酶，因而選用半纖維素酶進行色素提取。

2.3.4 料液比對紫薯色素提取的影響 由圖8可知，隨著檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液量的增加，吸光度呈現出先平緩，再增長，后下降的趨勢。這是因為如果提取劑的量不夠，無法使提取劑完全滲入紫薯細胞溶解色素，不足以使色素從細胞內擴散出來;之后隨著提取劑量的增加，滲入紫薯粉中的提取劑增多，形成內高外低的滲透壓，使色素逐漸被溶解;當提取劑過量，稀釋了酶的濃度，使提取率降低。趙二勞等[29]在對紫薯色素提取工藝研究中得出最佳料液比為1∶25，與本試驗結果一致，因此最佳料液比初步認定為1∶25。

2.3.5 酶用量對紫薯色素提取的影響 由圖9可知，在5～25 U·mL-1隨著酶濃度的增加，吸光度呈現出先增長，后下降的趨勢。隨著酶濃度的增加，紫薯細胞內半纖維素的降解速率加快，從而加大細胞內色素的滲透率;當酶分子被底物飽和后，增加酶量將不會增大紫薯色素的提取率。姚剛[30]在研究中表明最適酶量為20 U·g-1，與本試驗結果相近。同時考慮到經濟成本，初步確定酶用量為25 U·mL-1。

2.3.6 pH值對紫薯色素提取的影響 由圖10可知，紫薯色素提取適合在酸性條件下進行。從圖11中看出不同pH值下的顏色不同，主要由于不同的pH值導致紫薯色素的分子構型不同[31]，從而發生了顏色改變。初步確定最佳pH值為3.2。

2.3.7 酶解時間對紫薯色素提取的影響 由圖12可知，在15～30 min隨著時間的增加，紫薯細胞降解會隨之增加;在30～45 min變化不大;在45～60 min出現大幅下降，是因為長時間加熱破壞了酶的活性所致。李輝等[32]在研究中得出最佳酶解時間為45 min，與本試驗結果相近，經綜合考慮，選用最佳酶解時間為30 min。

2.4 正交試驗

為使試驗結果更加精準，提高紫薯色素的產率，設計出三因素兩水平L4（23）的正交試驗如表2、表3所示。

由表3中R值（極差）大小可推斷出對紫薯色素提取時各因素的影響程度順序為：pH值>酶用量>超聲時間。通過k值（平均值）的計算和比較，得到最佳工藝為：超聲時間20 min，酶用量25 U·mL-1，pH值為4.0，色素提取量為31.72 mg·（100 g）-1。

分別用超聲波-生物酶協同法、酶解法和超聲法在最佳工藝下進行紫薯色素提取，得到吸光度值分別為0.623，0.491，0.572。通過計算色素提取量分別為31.72，25.00，29.12 mg·（100 g）-1。由此可判斷出對于紫薯色素提取采用超聲波-生物酶法為最佳。

3 結論與討論

本文采用超聲波-生物酶協同法對紫薯色素進行提取，利用吸光度大小來衡量提取效果。從單因素試驗中得到如下結論：選用半纖維素酶提取效果要優于纖維素酶和α-淀粉酶;吸光度隨著酶用量的增加先增大后減小，在25 U·mL-1時達到最大值;隨著酶水解時間的增加吸光度先增大后減小，在45 min后迅速下降;紫薯色素提取適合在酸性條件下進行，隨著溶液pH值的增加吸光度呈現下降趨勢;吸光度隨著料液比的增加先增大后減小，最佳料液比為1∶25;隨著超聲時間的增加，吸光度在20 min時達到最大然后迅速降低;吸光度隨著超聲的升高先增大后減小，在60 ℃達到最大值。通過正交試驗得到最佳工藝為：超聲時間20 min，酶用量25 U·mL-1，pH值為4.0，色素提取量為31.72 mg·（100 g）-1。在紫外-可見吸收光譜中，紫薯色素在324 nm附近出酰基化峰，說明紫薯花青素比較穩定，適合運用到生活中。本文試驗方法簡單、便捷，使用的試劑成本較低、安全性高、效果好，具有可行性。

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