丙酮酸鈉對嚴(yán)重燙傷MODS小鼠胰島β細(xì)胞功能不全的保護(hù)作用

寧麗萍，王占科，周方強(qiáng)，郭 靚，王慶蒞，袁美晶，趙婉茹，張益明

多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)是指機(jī)體在嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克后相繼或同時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)及兩個(gè)以上系統(tǒng)或者器官功能不全或衰竭的全身綜合癥狀[1-2]。嚴(yán)重燙(燒)傷后經(jīng)常會發(fā)生器官結(jié)構(gòu)和功能的損傷[3]，住院重癥患者中發(fā)生MODS的病死率高[4-5]。嚴(yán)重MODS同時(shí)會出現(xiàn)不同程度的全身炎癥反應(yīng)[6]，胰腺組織容易受損，炎性細(xì)胞因子可以使胰島β細(xì)胞凋亡，胰島素分泌不足，導(dǎo)致傷后高血糖[7]。丙酮酸鈉是常見的丙酮酸鹽，分子式為C3H3NaO3，其在生物體系的三大物質(zhì)代謝中起著重要的樞紐作用，也是強(qiáng)有力的抗氧化和抗炎劑[8]。有研究顯示，丙酮酸鈉對心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、紅細(xì)胞等組織細(xì)胞功能具有保護(hù)作用[9]，但針對丙酮酸鈉保護(hù)嚴(yán)重燙傷MODS小鼠胰島β細(xì)胞功能的研究甚少。本研究探討丙酮酸鈉對嚴(yán)重燙傷MODS小鼠胰島β細(xì)胞功能的影響，為臨床早期診斷和防治MODS提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與材料 選取6～8周齡清潔級健康昆明小鼠，體重18～22 g，雌雄各半[購于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科技中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(贛)2018-0003，質(zhì)量合格證號：0001665]；丙酮酸鈉(美國Sigma公司，Lot：WXBB1321V，分析純)；內(nèi)毒素(E.coli 055:B5，美國Sigma公司，Lot:028M4094V，分析純)；水合氯醛(天津市福晨化學(xué)試劑廠，Lot：20131022，分析純)；血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、血肌酐(Cr)、肌酸激酶MB型同工酶(CK-MB)、血糖生化試劑盒購于深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；白介素-6(IL-6)試劑盒購于北京熱景生物技術(shù)股份有限公司；胰島素試劑盒購于南京建成公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購于重慶中元生物技術(shù)有限公司。

1.2儀器 BS-2000M型全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；DNM-9602G型酶標(biāo)儀(北京普朗公司)；UPT-3A上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析儀(北京熱景生物技術(shù)股份有限公司)；CTK-120型自動脫蓋離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；HH-W600型恒溫水浴箱(常州金壇恒豐儀器制造有限公司)。

1.3動物模型制備和分組 140只清潔級健康昆明小鼠在無菌包裝條件下，運(yùn)輸至中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇八醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室[實(shí)驗(yàn)室許可證號：SYXK(贛)2013-001]，清潔級小鼠在獨(dú)立送風(fēng)全膜終端過濾式(IVC)環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)，雌雄昆明小鼠隨機(jī)分為健康組(n=20)和MODS實(shí)驗(yàn)組(n=120)，MODS實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分為丙酮酸鈉治療組(n=60)和生理鹽水對照組(n=60)，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組再隨機(jī)分為傷后1、3和5 d組(n=20)，相同條件自由喂養(yǎng)。昆明小鼠腹腔注射3.3%水合氯醛麻醉[10]，根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]小鼠背部剪毛后，將剪毛處置于90℃水浴鍋中燙10 s，造成30%體表面積的Ⅲ度嚴(yán)重燙傷(經(jīng)病理切片證實(shí))，傷后2 h腹腔注射內(nèi)毒素(按5 mg/kg體重注射：1.0 mg/ml，5.0 ml/kg)[12]，同時(shí)腹腔注射生理鹽水1.0 ml抗休克，再于燙傷后8 h腹腔注射生理鹽水1.0 ml，嚴(yán)重燙傷小鼠于1 d后檢測ALT、血Cr、CK-MB、IL-6等指標(biāo)顯著高于健康組，并持續(xù)到傷后5 d，為嚴(yán)重燙傷MODS動物模型制備成功。

1.4給藥劑量和途徑 丙酮酸鈉治療組：參考文獻(xiàn)[13]配制2.5%的丙酮酸鈉液體：丙酮酸鈉4.48 g、氯化鎂0.05 g、氯化鈣0.183 g、氯化鈉5.38 g溶于750 ml重蒸水中，加入10%的葡萄糖注射液250 ml，最后用稀鹽酸下調(diào)pH值為4.5，過濾消毒，分裝4℃保存，使用前用恒溫箱孵熱至37℃?zhèn)溆茫∈螈蠖葒?yán)重燙傷后2 h腹腔注射內(nèi)毒素，同時(shí)腹腔注射2.5%丙酮酸鈉1.0 ml抗休克，再于傷后8 h腹腔注射2.5%丙酮酸鈉1.0 ml。生理鹽水對照組注射等量無菌生理鹽水。

1.5樣品采集及測定指標(biāo) 丙酮酸鈉治療組和生理鹽水對照組小鼠分別于傷后1、3、5 d心臟采血[14]，小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在21～25℃，空氣濕度保持在50%～55%，傷前健康組適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后空腹12 h心臟采血[15]，及時(shí)分離血清，置于-80℃超低溫冰箱保存，待檢，標(biāo)本統(tǒng)一凍融，采用酶法嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測血清ALT、Cr、CK-MB、血糖水平，SOD采用鄰苯三酚底物法在全自動生化儀上檢測；胰島素采用ELISA法在北京普朗DNM-9602G型酶標(biāo)儀上檢測,穩(wěn)態(tài)模型β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-β)=20×FINS/(FBG-3.5)[16]；IL-6用上轉(zhuǎn)發(fā)光法在UPT-3A上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析儀上檢測。

2 結(jié)果

2.1小鼠存活情況 Ⅲ度嚴(yán)重燙傷MODS小鼠生理鹽水對照組和丙酮酸鈉治療組傷前和傷后1、3、5 d存活率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組Ⅲ度嚴(yán)重燙傷MODS小鼠不同時(shí)間存活情況[只(%)]

2.2主要臟器功能指標(biāo)情況 丙酮酸鈉治療組和生理鹽水對照組傷后1、3、5 d血清ALT、Cr、CK-MB高于健康組(P<0.01)；丙酮酸鈉治療組傷后1、3、5 d血清ALT、Cr、CK-MB水平低于生理鹽水對照組(P<0.01)。見表2。

表2 3組小鼠血清ALT、Cr和CK-MB水平變化

2.3血清IL-6和SOD水平 丙酮酸鈉治療組和生理鹽水對照組IL-6水平高于健康組，SOD水平低于健康組(P<0.01)；丙酮酸鈉治療組傷后1、3、5 d的IL-6水平低于生理鹽水對照組(P<0.01)；丙酮酸鈉治療組傷后1 d SOD水平與生理鹽水對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，傷后3、5 d SOD水平高于生理鹽水對照組(P<0.01)。見表3。

表3 3組小鼠血清IL-6和SOD水平變化

2.4HOMA-β水平 健康組HOMA-β水平為341.56±35.97，生理鹽水對照組傷后1、3、5 d HOMA-β水平分別為163.28±17.90、131.44±15.20、137.07±16.45，丙酮酸鈉治療組分別為252.75±26.71、245.73±23.00、256.79±26.73。生理鹽水對照組傷后1、3、5 d HOMA-β水平低于健康組，丙酮酸鈉治療組1、3、5 d的HOMA-β水平高于生理鹽水對照組(P<0.01)。

3 討論

MODS在臨床中是常見的醫(yī)學(xué)主要問題，病死率高[17]，動物的MODS診斷定在致傷后24 h，發(fā)生多器官功能障礙診斷依據(jù)和人類的基本一致，采用實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)也基本相同[18]，本實(shí)驗(yàn)診斷指標(biāo)主要選擇ALT、Cr、CK-MB和IL-6。IL-6是二級炎癥反應(yīng)介質(zhì)的主要成分，有多種生物活性，可以敏感反映組織損傷的程度[19]，嚴(yán)重MODS時(shí)機(jī)體會發(fā)生不同程度的全身炎癥反應(yīng)[20]，炎性因子可以使得胰島β細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致胰島素分泌下降造成絕對或相對不足[7]。胰島β細(xì)胞是胰島細(xì)胞的一種，約占胰島細(xì)胞總數(shù)的70%[21]，創(chuàng)傷后機(jī)體還會存在胰島素抵抗造成血糖濃度升高，血糖應(yīng)激過度會進(jìn)一步促進(jìn)炎癥感染的發(fā)展[22-23]，穩(wěn)定血糖濃度在適當(dāng)?shù)姆秶鷮ODS的預(yù)后至關(guān)重要[24]，HOMA-β可以作為判斷MODS患者病情轉(zhuǎn)歸和預(yù)后的預(yù)警指標(biāo)[17，25-26]。

據(jù)文獻(xiàn)綜述報(bào)道，丙酮酸鈉是人體內(nèi)源性的一類小分子的化合物，不僅在紅細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、視神經(jīng)細(xì)胞等組織細(xì)胞有保護(hù)作用，外源性的丙酮酸鈉還可以在嚴(yán)重缺氧的情況下保護(hù)組織和器官的功能[9]，且無不良反應(yīng)[27]，在缺氧性乳酸性酸中毒(LA)中也具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值[28]。但是將丙酮酸鈉應(yīng)用在胰腺組織對胰島β細(xì)胞功能的保護(hù)作用鮮有報(bào)道，外源性的丙酮酸鈉可以通過腹腔復(fù)蘇提高細(xì)胞的缺氧耐受性，防止器官功能障礙及衰竭,提高實(shí)驗(yàn)動物的生存率[29-30]，直接腹腔復(fù)蘇還可以增加57%的胰腺血流量[31]。

本研究結(jié)果顯示，昆明小鼠制作Ⅲ度嚴(yán)重燙傷MODS模型時(shí)全部使用國內(nèi)較常用的麻醉藥水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉[32]。丙酮酸鈉治療組傷后1、3、5 d ALT、Cr、CK-MB及IL-6低于生理鹽水對照組，提示使用丙酮酸鈉腹腔注射可降低Ⅲ度嚴(yán)重燙傷MODS小鼠主要器官功能的損傷程度。丙酮酸鈉治療組傷后3、5 d SOD水平均高于生理鹽水對照組，可能是由于嚴(yán)重燙傷后，小鼠機(jī)體容易產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，而SOD是生物體內(nèi)非常重要的抗氧化酶，是清除氧化應(yīng)激反應(yīng)所產(chǎn)生的氧自由基的主要物質(zhì)[33-34]，文獻(xiàn)報(bào)道丙酮酸鈉可以減少氧自由基的含量，減少炎性細(xì)胞的浸潤，減輕對臟器的損傷[35-36]，可能是通過促進(jìn)SOD發(fā)揮作用或產(chǎn)生協(xié)同作用達(dá)到減輕損傷的效果。本研究結(jié)果顯示，丙酮酸鈉治療組各時(shí)間點(diǎn)HOMA-β水平高于生理鹽水對照組，提示丙酮酸鈉治療后胰島功能損傷有改善。胰腺組織中胰島β細(xì)胞調(diào)控細(xì)胞凋亡來穩(wěn)定血糖具有重要作用[37]，使用小容量的高滲丙酮酸鈉液較大容量的丙酮酸乙酯液更有效[38]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)制作的30% TBSAⅢ度嚴(yán)重燙傷MODS小鼠模型，讓其發(fā)生不同程度的全身炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激與炎性因子在疾病的發(fā)展中起到重要作用，使用丙酮酸鈉改善癥狀有效果。腹腔注射丙酮酸鈉液可以降低心臟、肝臟、腎臟功能酶指標(biāo)，降低胰腺組織氧化應(yīng)激,增加SOD濃度及降低IL-6水平，改善HOMA-β水平，實(shí)現(xiàn)嚴(yán)重燙傷MODS胰腺組織胰島β細(xì)胞功能不全的保護(hù)作用，丙酮酸鈉治療組和生理鹽水對照組小鼠存活率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與小鼠數(shù)量少有關(guān)。本研究得出的結(jié)論僅是從動物實(shí)驗(yàn)中獲得的，在臨床研究中是否也具有這種保護(hù)作用可能需要進(jìn)一步的探討。