叢毛單胞菌對鄰甲酚及對甲酚的降解特性*

張立志 余思彤 袁 欣 王 鈺 宋兆健 包永明 張旭旺

(大連理工大學海洋科學與技術學院，遼寧 盤錦 124221)

隨著工業化進程的推進，我國對煤炭資源的消耗日益嚴重，產生了大量含有油、酚、氨等污染物的工業廢水[1-3]。污水處理廠進水中的酚類物質可達300～800 mg/L[4]296。酚類廢水中，以苯酚和甲酚造成的污染最嚴重。其中，鄰甲酚和對甲酚同屬于甲酚同分異構體，在日常生活中應用廣泛。這兩種同分異構體具有強烈的腐蝕性及毒性，被美國環境保護署列入環境優先控制污染物的黑名單，同時也是我國重點控制污染物之一[5]。

生物法因處理效率高、操作簡單、成本低廉而受到廣泛關注。BAYLY等[6]開展了利用假單胞菌(Pseudomonassp.)菌株突變體降解苯酚和甲酚的研究。RIHAM等[7]研究了固定在聚乙烯醇凝膠中的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)降解對甲酚的能力，結果表明，對甲酚為200 mg/L時降解效果最佳。ELENI等[8]發現，嗜堿菌小球藻(Advenella)LVX-4在對甲酚為750 mg/L的高濃度條件下也具有降解對甲酚的能力。目前，已有較多關于甲酚降解菌特性的研究，已報道菌株資源還包括蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)[9]、泛影桿菌(Diaphorobacter)[10]、農桿菌(Citrobacterfarmeri)[11]等；關于叢毛單胞菌(Comamonassp.)對甲酚降解的研究較少，大多是對染料廢水、聚-β-羥丁酸(PHB)、氨氮、苯、苯酚及喹啉等污染物的去除[12-13]。甲酚好氧生物降解路徑主要有兩種：一種為龍膽酸途徑[14]531-532；另一種為兒茶酚途徑[15]373-376。兩者均需在雙加氧酶的作用下使苯環斷裂，進而進入下游代謝。

本課題組自大連某污水處理廠活性污泥中分離出一株可降解喹啉的Comamonassp. Z1(以下簡寫為Z1)，研究發現，Z1能降解鄰甲酚與對甲酚。因此，設計實驗考察其對鄰甲酚和對甲酚的降解特性及路徑。本研究在豐富可降解甲酚生物資源的同時，也可為實際含酚廢水的生物處理提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株

Z1的16S rRNA基因序列的GenBank號為MF07332[16]。在100 mL的無機鹽培養基中，分別加入一定濃度的鄰甲酚與對甲酚作為唯一碳源與能源，接種量占5%(體積分數)，在pH=7.0、30 ℃、150 r/min下振蕩培養24 h。

1.2 培養基

無機鹽培養基：Na2HPO4·12H2O 3.28 g/L，KH2PO42 g/L，(NH4)2SO42 g/L，FeCl30.25 mg/L，pH=7.0。

1.3 主要試劑與儀器

鄰甲酚、對甲酚、丙酮、乙酸乙酯及各類金屬鹽等均為分析純，甲醇為色譜純。

紫外-可見分光光度計(UH5300，日本HITACHI公司)；高效液相色譜(HPLC)儀(LC-2030C 3D，日本島津公司)；四級桿軌道離子阱高分辨質譜(MS)儀(Q Exactive，美國Thermo Fisher公司)。

1.4 生物降解實驗

與微生物去除污染物這一過程密切相關的環境因素包括底物濃度、pH、金屬離子、溫度及溶氧量等。實驗選擇對生物去除底物影響較大且考察較普遍的環境因素進行研究，包括底物濃度、pH、金屬離子。在已有關于Comamonassp.的研究報道中，其在29～35 ℃培養時，PHB的降解效果最好[17]。固定化水生叢毛單胞菌(Comamonasaquatica)LNL3降解氨氮的最適溫度為30 ℃[18]。Comamonassp. JB降解苯、甲苯、二甲苯的實驗，睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)ZD4-1降解苯酚的實驗均以30 ℃為最適培養條件[19-20]。文獻報道中以振蕩培養的方式提供生物降解活動中需要的氧。因此，本研究也選擇在30 ℃下振蕩培養。

未特別說明，實驗條件一般為：在裝有25 mL無機鹽培養基的錐形瓶中分別加入50 mg/L鄰甲酚或100 mg/L對甲酚，不額外增加金屬離子，在接種量5%、pH=7.0、30 ℃、150 r/min下振蕩培養，定時取樣監測Z1的生長情況及殘留的鄰甲酚或對甲酚濃度。

(1) 底物濃度影響：分別加入25～125 mg/L鄰甲酚或25～300 mg/L對甲酚。

(2) pH影響：設置pH為5.0～9.0。

(3) 金屬離子影響：選擇環境中常見的金屬離子(Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ni2+、Mn2+、Co2+、Cd2+)，均以0.5 mmol/L加入無機鹽培養基中。

1.5 分析方法

(1) 菌株生長情況以660 nm下的吸光度表示，以紫外-可見分光光度計測定。鄰甲酚與對甲酚的殘留濃度采用HPLC分析，降解中間產物的鑒定采用HPLC/MS分析。

(2) HPLC分析：間隔一段時間，取反應液加入適量乙酸乙酯，振蕩萃取10 min，取1.5 mL上清液過0.45 μm有機濾膜后進行HPLC分析。HPLC條件：Hypersil ODS2色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，流速1.0 mL/min，進樣量5 μL，流動相為水/甲醇。梯度洗脫：0～15 min，40%(體積分數，下同)～80%甲醇；15～20 min，40%甲醇。

(3) HPLC/MS分析：選取菌株對數生長中期與末期，間隔一段時間，取反應液加入適量乙酸乙酯，振蕩萃取10 min，取5 mL上清液，用氮吹至1 mL，經0.45 μm有機濾膜過濾后進行HPLC/MS分析。HPLC條件：流速0.5 mL/min，進樣量10 μL，柱溫40 ℃。梯度洗脫：0～1.0 min，5%～95%甲醇；1.0～7.0 min，95%甲醇；7.0～7.1 min，5%甲醇；7.1～8.0 min，5%甲醇。MS條件：采用電噴霧離子源，霧化室溫度320 ℃，以氮氣為保護氣和干燥氣，進行正、負模式掃描。

2 結果與討論

2.1 底物濃度對Z1降解鄰甲酚與對甲酚的影響

煤化工廢水中可能含有多種酚類化合物，且因其具有生物毒性而對微生物的生長及代謝產生影響。實驗探究了不同質量濃度鄰甲酚與對甲酚對Z1的生長及其降解的影響，結果見圖1。Z1可利用鄰甲酚與對甲酚作為唯一碳源進行生長，36 h內能將25～75 mg/L鄰甲酚、25～200 mg/L對甲酚完全降解。當鄰甲酚為25～100 mg/L時，Z1最大生長量隨著質量濃度的增大而提高。25 mg/L時Z1生長延滯期較短，其他濃度條件下延滯期均達12 h。隨鄰甲酚濃度的增大，Z1完全降解所需時間延長。25 mg/L時24 h可完全降解，125 mg/L時需48 h才能實現完全降解。與鄰甲酚相比，Z1對對甲酚的耐受性更高。Z1在對甲酚為25～200 mg/L時表現出良好的降解性能，均可在36 h內完全降解。當對甲酚提高到300 mg/L時，Z1的生長受到明顯抑制，但36 h內仍可降解43.46%的對甲酚。從石化污水處理廠的活性污泥中分離出的鄰甲酚高效降解菌Pseudomonassp. JF2，可在20 h內將600 mg/L鄰甲酚完全去除[21]266。在小球藻(Chlorellavulgaris)處理煤氣化廢水的研究中，其降解對甲酚的耐受質量濃度高達400 mg/L[4]300。從石油煉制廢水中分離出的菌株芽孢桿菌(Bacillussp.)DBK4能在約2 d內將500 mg/L對甲酚完全降解[22]3。與它們相比，Z1對鄰甲酚與對甲酚的耐受性相對偏低，但仍可作為酚類廢水處理的有效候選菌株。

圖1 Z1的生長及其對不同質量濃度鄰甲酚與對甲酚的降解Fig.1 Growth of Z1 and degradation of o-cresol and p-cresol under different mass concentrations

2.2 pH對Z1降解鄰甲酚與對甲酚的影響

參與生化降解反應的酶活易受環境pH影響。實驗探究了不同pH對Z1生長及降解鄰甲酚與對甲酚的影響，結果見圖2。Z1以鄰甲酚為碳源，當pH為5.0～8.0時，Z1生長延滯期較短(6 h)；當pH為9.0時，Z1生長延滯期延長至30 h，且生長抑制明顯。當pH為5.0、6.0時，Z1對鄰甲酚的降解周期延長；當pH為7.0～9.0時，鄰甲酚降解相對較快，pH為8.0時Z1可在24 h內將50 mg/L的鄰甲酚快速降解。Z1以對甲酚為碳源，當pH為5.0時，Z1生長延滯期最長，可達12 h。當pH為6.0～9.0時，Z1可在24 h內將100 mg/L對甲酚降解完全；當pH為5.0時，降解受到嚴重抑制，雖仍能在36 h內完成降解，但降解周期相對較長。前期研究發現，印度膠質瘤(Gliomastixindicus)MTCC 3869降解對甲酚的最適pH為6.0[23]，Bacillussp. DBK4降解對甲酚的最適pH為7.0[22]4，Pseudomonassp. JF2降解鄰甲酚的最適pH為7.0～8.0[21]267。與之相比，本研究中Z1則可在pH為8.0時，分別將50 mg/L鄰甲酚或100 mg/L對甲酚快速降解。

圖2 不同pH下Z1的生長及其對鄰甲酚與對甲酚的降解Fig.2 Growth of Z1 and degradation of o-cresol and p-cresol under different pH

2.3 金屬離子對Z1降解鄰甲酚與對甲酚的影響

廢水中通常會含有Cu2+、Ni2+、Cd2+等金屬離子，它們可能對微生物酶活性產生影響，從而影響微生物的生長及其生化降解過程[24]1035-1036。課題組在前期研究中發現，0.1～1.0 mmol/L不同金屬離子對菌株生物降解過程的影響較顯著[25-26]。已有關于不同金屬離子對Comamonassp.生物合成及酶活影響的研究，如Comamonassp. IDO2合成靛藍的特性研究中，考察0.5 mmol/L不同金屬離子對其合成靛藍的影響，結果表明，Ba2+和Ca2+對靛藍的合成有明顯的促進作用，Mg2+幾乎無影響，而Cu2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+的抑制效果最明顯[27]；Comamonassp. UVS胞內藜蘆醇氧化酶的純化與表征及其在紡織染料脫色中的作用研究結果表明，該酶活被0.5 mmol/L的Cu2+、Zn2+、Hg2+和Cd2+分別抑制了85%、65%、48%、35%[28]。結合文獻，本研究選擇0.5 mmol/L作為實驗條件，結果如圖3所示。降解過程中，Co2+、Ni2+、Cu2+對Z1生長、底物降解抑制作用明顯，Zn2+、Mn2+、Cd2+也對Z1生長、底物降解有一定的抑制作用，而Mg2+對Z1生長、底物降解產生促進作用。研究表明，Mg2+對許多生物過程具有顯著影響，并且在激活酶、調節代謝和穩定核苷酸結構方面具有不可或缺性[29]。Co2+、Ni2+、Cu2+等金屬離子的加入，使甲酚類降解周期延長，這可能與金屬離子能與酶的巰基結合使酶失活相關[24]1035-1036。

圖3 不同金屬離子對Z1生長及其對鄰甲酚與對甲酚降解的影響Fig.3 Growth of Z1 and the effect on the degradation of o-cresol and p-cresol by different metal ions

2.4 降解產物分析

利用HPLC/MS對Z1降解鄰甲酚的產物進行分析，檢測到5種中間產物，分別為2-羥基苯甲醇(質荷比(m/z)=123.045 15)、2-羥基苯甲醛(m/z=121.029 50)、2-羥基苯甲酸(m/z=137.024 42)、2-羥基-6-酮庚-2，4-二烯酸(m/z=155.034 98)和2-羰基-4-烯戊酸(m/z=114.032 24)。在AHAMAD等[15]373-376所開展的利用Pseudomonassp. CP4降解鄰甲酚的研究中，核磁共振氫譜分析也檢測出2-羥基-6-酮庚-2，4-二烯酸和2-羰基-4-烯戊酸這兩種中間產物。

對甲酚的降解過程中檢測到4種中間產物，分別為4-羥基苯甲醇(m/z=123.04 515)、4-羥基苯甲醛(m/z=121.029 50)、4-羥基苯甲酸(m/z=137.024 42)和龍膽酸(m/z=153.019 33)。這幾種中間產物在Bacillussp. PHN1降解對甲酚的過程中均被檢測到[14]531-532。

2.5 降解路徑分析

通常，鄰甲酚首先被氧化生成3-甲基兒茶酚或4-甲基間苯二酚，然后進入兒茶酚降解途徑進一步被降解[15]371-373。而微生物則可通過兩種途徑降解對甲酚：(1)通過與鄰甲酚降解類似的苯環羥化過程，形成4-甲基兒茶酚，然后經兒茶酚途徑進入下游代謝[30]；(2)首先攻擊甲基，然后甲基被氧化成羧基，生成龍膽酸，進入龍膽酸降解途徑[31]4-5。

注：括號內物質表示實際未檢測到而推測的物質。圖4 Z1對鄰甲酚與對甲酚的降解路徑推測Fig.4 Possible pathways for the degradation of o-cresol and p-cresol by Z1

根據HPLC/MS分析結果，結合文獻推測Z1降解鄰甲酚可能存在兩種途徑(見圖4(a))：(1)鄰甲酚首先通過甲基位的羥化及羧化過程，依次被氧化為2-羥基苯甲醇、2-羥基苯甲醛及2-羥基苯甲酸(水楊酸)，因降解方式與已知降解模式類似，所以猜測隨后進入龍膽酸降解途徑[31]4-5。(2)鄰甲酚首先被氧化生成3-甲基鄰苯二酚，隨后進入兒茶酚降解途徑，即經間位開環依次形成2-羥基-6-酮庚-2，4-二烯酸和2-羰基-4-烯戊酸，然后進一步被降解，最終礦化。這一途徑與Pseudomonassp. CP4降解鄰甲酚的過程相同[15]373-376。因此，推斷Z1能利用龍膽酸與兒茶酚途徑降解鄰甲酚。

Z1降解對甲酚可能途徑(見圖4(b))：對甲酚首先被氧化生成4-羥基苯甲醇，而后經脫氫、氧化形成4-羥基苯甲醛、4-羥基苯甲酸、龍膽酸，最后進入龍膽酸降解途徑。該路徑與Bacillussp. PHN1降解對甲酚的過程相同[14]531-532，所以Z1通過龍膽酸途徑降解對甲酚。

3 結 論

(1) Z1可利用鄰甲酚與對甲酚作為唯一碳源進行生長，36 h內能將25～75 mg /L鄰甲酚、25～200 mg/L對甲酚完全降解。

(2) Z1可在pH為8.0時將50 mg/L鄰甲酚或100 mg/L對甲酚快速降解。

(3) Mg2+對Z1生長、底物降解產生促進作用，Co2+、Ni2+、Cu2+等金屬離子則具有抑制作用。

(4) 推斷Z1能利用龍膽酸與兒茶酚途徑降解鄰甲酚，通過龍膽酸途徑降解對甲酚。