硫酸亞鐵法和Fontana法顯示黑色素的比較研究

張冰娜，張丹桂，葉丹彥，洪楚珠，楊旅軍

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 汕頭 515041）

在常規(guī)的病理切片或者在其他切片的檢查中，顯微鏡下可見到細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙中所出現(xiàn)的帶有顏色的顆粒，這些帶有顏色的顆粒，不管是機(jī)體產(chǎn)生的，還是從體外進(jìn)入組織的，都被稱為色素。色素的存在影響切片的觀看和診斷、切片的美觀及圖片的拍攝效果。有些色素應(yīng)用特殊的方法顯示出來后有助于疾病的診斷。

黑色素屬于內(nèi)源性色素中非血源性色素的一種，鏡下可見該色素為淡黃色、金黃色或深褐色的顆粒，大小不等、形狀不一，比較均勻地分布于細(xì)胞胞漿之內(nèi)或胞質(zhì)的邊緣。黑色素細(xì)胞含有合成黑色素所必需的酪氨酸，絡(luò)氨酸將黑色素原生物質(zhì)氧化成黑色素。人體中的黑色素主要存在于皮膚的基底細(xì)胞中[1]。利用多巴氧化酶法、硫酸亞鐵法和Fontana法可對黑色素細(xì)胞進(jìn)行染色。其中多巴氧化酶法要求采取新鮮組織或組織固定于5%甲醛液且固定時間不能超過3 h，由此制成冰凍切片。對于常規(guī)包埋的石蠟切片，目前對黑色素細(xì)胞進(jìn)行染色使用最多的方法是硫酸亞鐵法和Fontana法，本研究比較這兩種染色法對皮膚黑色素顆粒的染色效果。

1 材料與方法

1.1 動物造模

取6只體重350 g左右的黃棕色豚鼠，分成2組：3只正常組，3只處理組。在處理組的豚鼠背部剃出10個1.6 cm×1.6 cm大小的區(qū)域，使用360 mJ/cm2的中波紅斑效應(yīng)紫外線(ultraviolet radiation B，UVB)照射2周，觀察色素沉著情況[2]。

1.2 組織包埋

分別取下正常組和處理組的豚鼠皮膚，4%多聚甲醛固定24 h，組織塊沖水24 h，70%酒精浸泡24 h，80%酒精浸泡12 h，90%酒精浸泡12h，95%酒精Ⅰ浸泡2 h，95%酒精Ⅱ浸泡2 h，100%酒精Ⅰ浸泡1 h，100%酒精Ⅱ浸泡1 h，二甲苯Ⅰ浸泡30 min，二甲苯Ⅱ浸泡30 min，軟蠟浸泡1 h，硬蠟浸泡2～3 h。

1.3 黑色素染色方法

1.3.1 硫酸亞鐵法 配制試劑：(1)2.5%硫酸亞鐵溶液；(2)用鐵氰化鉀1 g，蒸餾水99 mL，冰醋酸1mL配制鐵氰化鉀醋酸溶液；(3)1%醋酸溶液。操作步驟：切片脫蠟水化；2.5%硫酸亞鐵溶液處理切片60～90 min或用隔水浴30 min；蒸餾水洗數(shù)次，約5 min；鐵氰化鉀醋酸溶液處理切片30～40 min或用隔水浴15 min；1%醋酸溶液分化切片10～20 s；VG復(fù)染1 min；95%酒精分化；脫水、透明并封片。

1.3.2 Fontana法 配制試劑：(1)配制氨銀溶液，取10%硝酸銀溶液20 mL，逐滴加入濃氨水，形成沉淀，繼續(xù)加入濃氨水，至初形成的沉淀物被溶解為止。如果加入的濃氨水過多，必須逐滴地加入10%硝酸銀溶液，直至溶液出現(xiàn)微渾濁。該溶液必須在加入20 mL蒸餾水，過濾后才可使用。將該溶液保存于4℃冰箱內(nèi)，大約可使用1個多月；(2)0.1%氯化金溶液；(3)5%硫代硫酸鈉溶液。操作步驟：切片脫蠟水化，蒸餾水洗數(shù)次；浸入氨銀溶液于暗處浸染12～24 h；蒸餾水洗數(shù)次；0.1%氯化金水溶液調(diào)色5 min；蒸餾水洗數(shù)次；5%硫代硫酸鈉水溶液定色5 min；流水沖洗5 min；伊紅復(fù)染2 min；脫水、透明并封片。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果

正常組的豚鼠皮膚比較薄(圖1A)，UVB照射2周后的豚鼠皮膚表皮呈輕中度增厚(圖1B)。肉眼可見，紫外線照射早期，皮膚出現(xiàn)紅點，后期顏色逐漸加深，并出現(xiàn)皮膚老化癥狀。

圖1 正常豚鼠與UVB照射后豚鼠皮膚(HE染色，×200)

2.2 黑色素染色結(jié)果對比

分別用硫酸亞鐵法與Fontana法對正常組豚鼠皮膚(圖2A、B)和UVB照射組皮膚(圖3A、B)進(jìn)行染色，結(jié)果顯示UVB照射組皮膚含黑色素顆粒的細(xì)胞數(shù)比正常組明顯增多。硫酸亞鐵法(圖3A)中，黑色素顯示綠至墨綠色；Fontana法(圖3B)中，黑色素、親銀顆粒和嗜鉻顆粒均顯示黑色。

3 討論

本研究表明硫酸亞鐵法與Fontana法均能對豚鼠皮膚黑色素進(jìn)行著色，顯示照射UVB的豚鼠皮膚含黑色素顆粒的細(xì)胞數(shù)比正常豚鼠皮膚的明顯增多。Fontana法是利用黑色素將氨銀溶液還原成金屬銀的反應(yīng)原理來顯示黑色素[3]。Perls氏溶液臨用前需新鮮配制，不宜久存。染色過程中，應(yīng)避免用生銹及其他可能造成貼紙的普通水洗，而應(yīng)用蒸餾水洗，防止氯銀渣污染玻片，影響觀察。切片在氨銀溶液中浸染時，要在鏡下觀察以控制最佳染色時間，避免染色時間久，把脂褐素和橙色血質(zhì)染成黑色。Fontana法顯示黑色素顆粒為黑色，但也使親銀顆粒和嗜鉻顆粒均顯示為黑色。所以銀染陽性的細(xì)胞只能說明含有黑色素，而不能證明就是黑色素細(xì)胞。另外此法作用時間長。與Fontana法對比，硫酸亞鐵法的染色特異性較強(qiáng)，結(jié)果可靠，操作簡便，時間短。硫酸亞鐵法染色過程水浴溫度和時間較難控制[4]。所用的試劑必須新鮮配制，否則不能獲得理想的結(jié)果[5]。

圖2 檢測正常豚鼠皮膚黑色素(×400)

圖3 檢測UVB照射2周后豚鼠皮膚黑色素(×400)

綜上所述，硫酸亞鐵法對皮膚黑色素顆粒染色的特異性較強(qiáng)，操作簡便，比較適合于臨床病理檢查及實驗室研究。當(dāng)然隨著免疫組織化學(xué)方法的廣泛開展，現(xiàn)在應(yīng)用組織化學(xué)方法檢測黑色素已經(jīng)較少用[6]。