生物絮團系統(BFT)中PHBV為碳源對斑點叉尾鮰生長、水質及硝化反應的影響

邵李娜，Abakari Godwin，羅國芝,2,3，譚洪新,2,3，楊逸遵

(1.上海海洋大學上海水產養殖工程技術研究中心，上海 201306；2.上海海洋大學農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306；3.上海海洋大學水產科學國際級實驗教學示范中心，上海 201306)

斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)食性雜、生長快、抵抗力強，對水中懸浮顆粒物有較強的耐受性，可應用于生物絮團技術(biofloc technology,BFT)養殖[1,2]。BFT技術通過絮團中的微生物將殘餌、糞便中的營養物質轉化為生物質，避免水體中氨氮的積累進而實現養殖水質的原位控制術、并能利用絮團促進養殖動物生長[3]。硝化過程被證明是BFT系統中氨氮的主要轉化途徑之一，原理是氨氧化微生物( ammonia oxidizing archaea,AOA[4]；ammonia oxidizing bacteria,AOB[5])在氨單加氧酶(ammonia monooxygenase,AMO)催化下將氨氧化成羥氨之后,在羥氨氧化還原酶(hydroxylamine oxidereductase,HAO)作用下被氧化為亞硝酸 ，最后亞硝酸氧化細菌( nitrite oxidizing bacteria,NOB)通過亞硝酸氧化還原酶(nitrite oxidereductase,NOR)將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽[6]，或是由全程氨氧化微生物主導的單步硝化作用[7-8]。其中，AMO、HAO和NOR則是硝化過程中重要生物酶，催化著硝化反應的進行，并對其起到一定的制約作用。

生物絮團系統需要添加碳源以維持異養細菌的生長，傳統碳源如葡萄糖、糖蜜、甘油等降解迅速，需要頻繁添加，易添加不足或過量。生物可降解塑料如3-羥基丁酸-co-3-羥基戊酸共聚物(poly 3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate,PHBV)、聚-β-羥丁酸(poly-β-hydroxybutyrate,PHB)、聚己內酯(polycaprolactone,PCL)等生物可降解聚合物可緩慢釋放有機物[9,10]，被證明能夠為BFT養殖過程提供穩定的有機碳源[9]。研究表明， BFT中添加PHB，可促進羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)[11]、羅非魚(Oreochromismossanbicus)[12]、南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)[13]等的生長，并提高其抗病力，Qiao等[14]也發現PHB在腸道微生物作用下，可提高養殖動物的免疫力和抗病力。在BFT系統中將生物可降解聚合物作為碳源對養殖動物確有裨益，但其對于硝化過程中硝化酶的影響卻未見報道。本實驗通過在生物絮團中添加PHBV，研究其對斑點叉尾鮰生長、水質、硝化反應速率及其過程中各硝化酶的含量與分布影響，旨在從硝化反應各階段的酶的角度，揭示添加PHBV對斑點叉尾鮰生長、水質及硝化反應的影響，進一步闡明硝化酶與硝化反應的關系，為BFT中緩釋碳源的添加以及硝化反應的優化提供理論依據與實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗斑點叉尾鮰苗購于廣東粵強豐水產有限公司，魚苗健康有活力，體重為(9.25±2.53)g,體長為(8.63±0.8)cm,暫養2周。飼料購于通威飼料有限公司，為膨化配合飼料，其營養成分為:粗蛋白≥32.0% ，粗纖維≤13.0%，粗脂肪≥4.0%，粗灰分≤15.0%，水分≤12.5%。PHBV顆粒購于東莞市凱茜利塑膠原料有限公司。

1.2 實驗設計

本實驗共6個養殖桶，有效水體300 L，期間以一臺羅茨鼓風機(750 W)供給曝氣，維持溶解氧>5 mg/L。實驗分為兩組，每組三個重復，第一組不添加PHBV，為對照組(CL組)，第二組掛袋PHBV 顆粒(300 g)，為實驗組(PHBV組)。實驗開始前，以福建高農有限公司出產的鰻鱺飼料(粗蛋白≥ 48%、粗灰分≤ 17%、粗脂肪≥ 4%、水分≤ 10%)為氮源，葡萄糖作為碳源，進行生物絮團的預培養，每2 d檢測總氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽、溶解有機碳，培養周期為42 d，使初始總固體懸浮物(total suspended solid,TSS)為200 mg/L。培養結束后，每個桶放入30尾斑點叉尾鮰魚苗，養殖周期為29 d。每天投喂4次，投喂率為體重的5%。每4 d檢測水質及絮團相關指標，養殖期間不換水，不排出絮體，僅補充取樣和蒸發而損耗的水，并及時添加小蘇打以穩定pH。

1.3 各項指標檢測方法及公式

1.3.1 水質指標檢測方法

1.3.2 生長指標計算公式

成活率(SR)=(N2/N1)×100%

(1)

增重率(WGR)=(W2-W1)/W1×100%

(2)

特定生長率(SGR)=(lnW2-lnW1)/t×100%

(3)

餌料系數(FCR)=F/(W2-W1)

(4)

式中，N1：實驗開始魚的數量；N2：實驗結束時魚的數量；W1：實驗開始時魚的體重(g)；W2：實驗結束時魚的體重(g)；t：養殖天數(d)；F：飼料投喂量(g)。

1.3.3 絮團采樣及檢測方法

全菌絮團采樣時，每組于3個反應器各取50 mL，混合后經高溫滅菌的0.22 μm醋酸纖維濾膜過濾；固著菌絮團采樣時需靜置5～10 min，等絮團沉降完全后，將上清液棄置，僅過濾沉降后的絮團，將濾膜折疊放入滅菌離心管，置于-20 ℃冰箱存放待測。

全菌絮團及固著菌絮團的 AMO、HAO及NOR含量的測定均采用ELISA試劑盒(上海茁彩生物科技有限公司)測定，游離菌的AMO、HAO及NOR含量為兩者之差。

1.4 數據分析

采用統計軟件SPSS 19.0對數據進行ANOVA 單因素方差分析，兩組間數據結合獨立樣本t檢驗進行均值差異性分析，酶含量數據結合Duncan 氏法進行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 實驗結果

2.1 生長及水質指標

表1 養殖期間斑點叉尾鮰生長指標Tab.1 Growth performance of I.punctatus during cultivation

圖1 養殖過程中及的變化趨勢Fig.1 Trend of during cultivation

2.2 連續監測中三態氮的變化

圖2 養殖過程中TN、TP、DOC及DOC/TAN的變化趨勢Fig.2 Trend of TN、TP、DOC and DOC/TAN during cultivation

圖3 養殖過程中絮團指標TSS及FV的變化趨勢Fig.3 Trend of floc index TSS and FV during cultivation

2.3 連續監測中硝化酶的變化

圖4 降解10 mg/L NH4Cl三態氮的變化趨勢Fig.4 Trend of three-state nitrogen while degradating 10 mg/L NH4Cl

圖5 TAN最高最高(B1/B2)及最高(C)時刻BFT中固著及游離硝化菌中AMO、HAO、NOR的含量Fig.5 Content of AMO,HAO and NOR of fixed and free nitrifying bacteria in BFT at the time of TAN maximum maximum(B1/B2)and maximum(C)

從固著菌及游離菌來看，PHBV組固著菌中的AMO、HAO、NOR均顯著多于CL組，AMO含量CL組的固著菌無顯著差異，PHBV組則在B2時顯著大于A、C；HAO含量CL組的固著菌在B1時刻顯著小于其他兩時刻，PHBV組則在A時顯著大于其他兩時刻；NOR含量CL組的固著菌在B1時顯著大于A、C，而PHBV組均無顯著差異。除CL組C時刻NOR含量外，兩組固著在生物絮團上的硝化細菌均顯著多于游離于水體的細菌。PHBV組游離菌中AMO、HAO及NOR的含量與PHBV組并無顯著差異，并未因三者總含量較少而減少，反而提高了CL組整個水體中游離硝化菌的占比。

3 討論

3.1 PHBV對斑點叉尾鮰生長及養殖水質的影響

本實驗經過29 d的養殖周期，兩組的成活率、增重率、特定增長率以及飼料系數均無顯著差異，與Chen等[17]發現PCL作碳源可促進革胡子鯰魚(Clariasgariepinus)生長的結果不符，可能是養殖周期短的原因。

3.2 PHBV對硝化反應三態氮變動的影響

3.3 PHBV對硝化反應硝化酶的影響

氨氧化階段是硝化反應的第一階段，因氨氧化微生物中的AMO只能氧化非離子氨(NH3)，使其成為硝化作用的限速階段[27-29]。因此雖然本實驗中PHBV組的AMO、HAO、NOR含量均顯著大于CL組，但限制硝化反應速率的只有AMO含量，與HAO、NOR含量關系不大。有研究發現土壤中的硝化速率與AOB的含量成正比，而與 AOA之間的關系并不明顯[30,31]，因本實驗無法根據AMO含量判斷AOA與AOB的具體數量，因此可能PHBV組AOA的比例較高，導致其AMO含量雖顯著大于CL組，但其硝化速率也并未提高。表明硝化反應速率與酶含量并不成正比，即使有著相同酶含量，不同種類的細菌對于硝化反應的作用也不同，體現了水體微生物的多樣性及復雜性。

水體中固著在絮團上的硝化酶含量要顯著多于游離于水體的，表明硝化細菌更傾向于固著于載體工作，此結論與李秋芳等[32]發現RAS中硝化細菌是生物膜上的優勢菌的結論相符。有趣的是，游離硝化菌的酶含量在各時刻卻較為穩定，不會因總酶量的減少而按比例降低。

4 結論