虎杖提取物對尼羅羅非魚脂肪肝的干預作用

馬良驍，賈 睿

(1.湖北至正天辰生物科技有限公司，武漢 430070；2.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心， 江蘇無錫 214081)

近年來，隨著水產養殖規模化、集約化程度提高，魚類肝臟疾病頻繁發生，如肝膽綜合征、化學性肝損傷以及脂肪性肝損傷，嚴重制約著魚類健康養殖發展[1,2]。其中，以脂肪肝或脂肪性肝損傷為主要特征的肝臟疾病越來越受到研究者和生產者的關注。魚類脂肪性肝病與肝臟脂肪代謝紊亂、氧化應激、炎癥反應以及肝細胞壞死有關[3,4]。水產養殖中，營養過剩、環境應激、病原菌感染、基因突變等均可導致脂肪肝的發生[5]。脂肪肝的危害主要包括降低生長、飼料利用率、免疫力、應激耐受性和產品感官等，對水產養殖業和市場消費者造成相當大的負面影響[6]。

虎杖(Polygonumcuspidatum)為蓼科植物，為我國傳統中藥，其根莖含有多種藥理活性成分，如蒽醌類、二苯乙烯類、萘醌類、黃酮類等[7-9]。早期研究表明，虎杖提取物可有效抑制小鼠(Musmusculus)肝組織中甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)沉積，改善脂肪代謝[10]。除此之外，虎杖提取物還可提高小鼠抗氧化能力、抑制炎癥因子生成、緩解四氯化碳引起的肝損傷[11]。杜金梁等[12]研究發現虎杖提取物能有效提高鯉(Cyprinuscarpio)肝細胞抗氧化能力，抑制肝細胞損傷。但關于虎杖提取物對魚類脂肪肝病干預方面的研究還未見報道。本研究以尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)為研究對象，用高脂飼料誘導建立脂肪性肝損傷模型，同時在飼料中添加虎杖提取物，探究其對尼羅羅非魚脂肪肝的干預作用，為魚類保肝飼料添加劑的開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

實驗用魚取自中國水產科學研究院淡水漁業研究中心漁場，體質健康，無傷，規格基本一致。實驗開始前，將尼羅羅非魚暫養于循環水養殖系統中(水溫：(30±3) ℃；pH 6.8～7.6；溶解氧>6 mg/L；總氨氮<0.1 mg/L；亞硝酸鹽<0.1 mg/L，每天換水10%)進行馴化，以適應實驗環境，并以3%體重的基礎飼料飼喂，每日兩次，連續14 d。

1.2 試劑

虎杖提取物(10 ∶1)購自于西安匯林生物科技有限公司；實驗所用的麻醉劑和磷酸鹽緩沖液購自于Sigma Company (St.Louis，MO，USA)。

1.3 試驗設計

將尼羅羅非魚隨機分為4組，正常組：飼喂基礎飼料(6%粗脂肪)；高脂組：飼喂高脂飼料(21%粗脂肪)；2.5 g/kg虎杖提取物處理組：飼喂含2.5 g/kg虎杖提取物的高脂飼料；5 g/kg虎杖提取物處理組：飼喂含5 g/kg虎杖提取物的高脂飼料。每組設3個重復，每個重復30尾魚。飼養60 d后，對所有魚稱重。然后每組隨機選取12尾魚，采集血液和肝組織。血液樣品通過離心(5 000 r/min，10 min)分離血清，儲存于-80 ℃備用。

1.4 生化指標測定

甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)、谷丙轉氨酶(GPT)、谷草轉氨酶(GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA) 等生化指標均按照相應的試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進行測定。

1.5 基因表達檢測

分別采集正常組、高脂組、2.5 g/kg虎杖提取物處理組以及5 g/kg虎杖物處理組的肝組織，檢測IL-1β和PPAR-α基因相對表達量。使用RNAiso Plus試劑(TaKaRa，大連)提取肝組織中總RNA，通過分光光度計檢測其含量和純度(A260/A280:1.8～2.1)，然后取適量的RNA(1 μg)，使用PrimeScriptTMRT試劑進行反轉錄，合成cDNA，操作方法根據試劑盒說明。

根據TB GreenTMPremix Ex TaqTMII kit說明檢測IL-1β和PPARα基因相對表達量：PCR反應條件：95 ℃、30 s預變性，然后 95 ℃、5 s變性，60 ℃、1 min退火延伸，40個循環。以β-actin為內參，使用2-△△Cq計算目標基因的相對表達量。特異性引物見表1。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 The primer sequences of qRT-PCR

1.6 計算公式

特定生長率(SGR，%/d)=100%×(lnWt-lnW0)/t

餌料系數(FCR)=FI/(Wt-W0)

式中，W0為魚初體均重(g)；Wt為魚末體均重(g)；t為飼喂天數(d)；FI為每尾魚平均攝食飼料總量(風干樣重)(g)。

1.7 數據統計分析

所有實驗數據使用SPSS 20.0軟件包進行數據分析，其值以均值±標準誤表示。各組間數據差異通過單因素方差進行(ANOVA)統計學分析，并對不同組間數據進行Tukey多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 虎杖提取物對尼羅羅非魚生長的影響

表2數據顯示，投喂60 d后，高脂組特定生長率(SGR)略低于正常組，而餌料系數略高于正常組，但均無顯著性差異，表明高脂飼料投喂60 d后對尼羅羅非魚生長無明顯影響。正常組、高脂組以及兩個虎杖提取物處理組的SGR和餌料系數均無顯著差異，表明不同劑量的虎杖提取物添加對尼羅羅非魚生長并無顯著影響。

表2 虎杖提取物對尼羅羅非魚生長的影響Tab.2 Effects of PCE on the growth of O.niloticus

2.2 虎杖提取物對尼羅羅非魚血脂水平的影響

高脂飼料投喂后，尼羅羅非魚TG、TC、LDL-c、HDL-c含量顯著升高。與高脂組相比，5 g/kg虎杖提取物組TG、TC、LDL-c、HDL-c含量均顯著降低；2.5 g/kg虎杖提取物組僅TG含量顯著降低。而兩個虎杖提取物處理組間無顯著差異。同時，虎杖提取物對尼羅羅非魚血脂水平的影響呈劑量依賴性，即5g/kg虎杖提取物組效果較好(圖1)。

圖1 虎杖提取物對尼羅羅非魚血脂水平的影響Fig.1 The effects of PCE on the blood lipid level in O.niloticus不同字母表示組間具有差異顯著P<0.05，下同

2.3 虎杖提取物對尼羅羅非魚血清GPT和GOT活力的影響

與正常組相比，高脂飼料投喂60 d后，尼羅羅非魚血清中GPT和GOT活性均顯著提高，表明尼羅羅非魚肝組織受損。 而經2.5 g/kg、5 g/kg虎杖提取物處理后， GPT活性均顯著下降；GOT活性也呈下降趨勢，但差異不顯著(圖2)。結果表明虎杖提取物可部分改善尼羅羅非魚肝損傷。

圖2 虎杖提取物對尼羅羅非魚GPT和GOT活性的影響Fig.2 The effects of PCE on GPT and GOT activities in O.niloticus

2.4 虎杖提取物對尼羅羅非魚肝臟中TG和TC含量的影響

由圖 3 可知，與正常組相比，高脂組中肝臟TG和TC含量均顯著升高。2種劑量虎杖提取物組中肝臟TG和TC含量均呈下降趨勢，但5 g/kg虎杖提取物組TG和TC含量顯著降低，表明高劑量虎杖提取物處理可有效改善尼羅羅非魚肝脂肪的沉積。

圖3 虎杖提取物對尼羅羅非魚肝TG和TC含量的影響Fig.3 The effects of PCE on hepatic TG and TC levels in O.niloticus

2.5 虎杖提取物對尼羅羅非魚肝組織抗氧化能力的影響

由圖4所示，高脂組SOD、T-AOC和GSH水平明顯低于正常組，而MDA含量明顯高于正常組，表明高脂飼料投喂引起氧化損傷和脂質過氧化。與高脂組相比，虎杖提取物組SOD活性顯著提高、T-AOC和GSH含量顯著增加， MDA含量顯著降低； 2.5 g/kg虎杖提取物組SOD活性顯著提高和GSH含量顯著增加， MDA含量顯著降低。表明虎杖提取物可有效阻止高脂飼料誘導的氧化損傷和脂質過氧化。

圖4 虎杖提取物對尼羅羅非魚肝組織抗氧化能力的影響Fig.4 The effects of PCE on anti-oxidative capacity in liver of O.niloticus

2.6 虎杖提取物對尼羅羅非魚IL-1β和PPAR-α基因表達的影響

由圖5可知，與正常組相比，高脂飼料投喂顯著上調了促炎性因子白細胞介素1β (IL-1β)基因表達，而顯著下調了過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)基因表達。與高脂組相比，2.5和5 g/kg虎杖提取物組顯著抑制了IL-1β基因表達；而5 g/kg虎杖提取物組PPAR-α基因表達顯著提高，表明虎杖提取物具有緩解炎癥反應和促進肝脂肪代謝的作用。

圖5 虎杖提取物對尼羅羅非魚IL-1β和PPAR-α基因表達的影響Fig.5 The effects of PCE on IL-1β and PPAR-α gene expression in liver of O.niloticus

3 討論

魚類脂肪肝經常伴隨著血脂水平的升高，如TG、TC、LDL-c和HDL-c。因此血脂水平常被用于脂肪肝評估。本研究結果顯示，高脂飼料投喂60 d后，尼羅羅非魚血脂水平顯著升高，表明尼羅羅非魚出現明顯的脂肪肝。而虎杖提取物處理后血脂水平明顯降低，表明虎杖提取物可調節脂肪代謝、降低血脂水平、緩解脂肪肝的發生。類似的結果在哺乳動物中也發現[13,14]。肝組織中過多的脂質沉積通常引起肝損傷，導致肝細胞膜通透性增強，細胞內可溶性酶，如GPT和GOT大量釋放進入血液。因此GPT和GOT是判斷肝損傷重要標志。本研究中，高脂飼料投喂60 d后，血清中GPT和GOT的活性顯著增加，表明高脂飼料投喂引起嚴重的肝損傷。而虎杖提取物明顯緩解了GPT活性上升，而對GOT活性無明顯影響。表明虎杖提取物可部分地緩解高脂飼料誘導的肝損傷。同樣，在鯉的研究中也顯示虎杖提取物可降低血清中GPT和GOT活性，抑制急性肝損傷[12,15]。

大量的研究發現，在脂肪肝發生和發展中，氧化應激發揮重要的作用。SOD、GSH和T-AOC是評價機體氧化應激狀態的重要指標[16-18]。而MDA 是氧化應激和脂質過氧化物的代謝產物，其含量變化反映了脂質過氧化程度。杜金梁等[15]研究發現，虎杖提取物能顯著提高T-AOC、SOD、GSH含量，降低MDA含量，防治鯉肝損傷。本研究數據顯示，高脂飼料引起肝組織抗氧化指標SOD、GSH和T-AOC水平降低，而5 g/kg虎杖提取物處理組中SOD、GSH和T-AOC水平顯著升高，表明高劑量虎杖提取物能促進尼羅羅非魚肝組織中抗氧化酶活力和抗氧化物質的形成，進而清除多余的自由基，抑制高脂飼料引起的氧化應激，阻礙進一步的肝損傷發生。同時，虎杖提取物顯著降低MDA含量，表明虎杖提取物能夠抑制肝組織中脂質過氧化的產生，阻止肝細胞細胞膜的結構與功能受損。這與在小鼠中的研究結果一致[14]。

研究表明長期的高脂飼料投喂可促使肝臟分泌炎癥因子，其中IL-1β為主要的促炎癥因子，在肝損傷發展過程中發揮重要的作用[19]。IL-1β可誘導其他炎癥因子、趨化因子和黏附分子分泌，參與炎癥反應、脂質代謝和免疫調節[20]。本研究結果發現，長期的高脂飼料投喂導致尼羅羅非魚肝臟炎癥基因IL-1β表達明顯上調，而IL-1β基因表達的上調在兩種劑量虎杖提取物處理組中均受到明顯抑制，表明虎杖提取物可抑制肝臟炎癥反應，阻礙肝組織進一步損傷。

肝細胞中，脂肪沉積主要與脂肪酸合成和β-氧化相關。PPAR-α為脂肪酸β-氧化的關鍵調控因子[21]。PPAR-α的上調可促進脂肪酸分解，降低脂質沉積。很多研究顯示，高脂飼料誘導的脂肪肝中，PPAR-α基因或蛋白表達被抑制[22,23]。本研究結果也顯示，高脂飼料投喂60 d后，尼羅羅非魚PPAR-α基因表達明顯下調，表明尼羅羅非魚脂肪肝發生與脂肪酸β-氧化抑制有關。而虎杖提取物處理后，PPAR-α基因表達明顯上調，表明虎杖提取物可促進肝細胞脂肪酸β-氧化，抑制脂肪過度的沉積，緩解脂肪肝發生。

綜上所述，虎杖提取物可干預高脂飼料引起的尼羅羅非魚肝脂肪代謝紊亂；同時可提高抗氧化狀態、抑制脂質過氧化和炎癥反應，緩解高脂飼料誘導的脂肪性肝損傷。