腎康靈對慢性腎臟病小鼠腎功能和自噬水平的影響

莊翔莉 艾 斯 鄭 健

(1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院 福建福州 350122；2.福建中醫藥大學附屬人民醫院 福建福州 350004；3.福建中醫藥大學中醫兒科研究所 福建福州 350122)

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是威脅全世界公共健康的主要疾病之一。CKD所致的腎功能下降呈不可逆性發展，并將逐漸進展至終末期腎病[1]，嚴重影響患者生活質量，且消耗了巨大的社會醫療資源。近年研究發現[2]，自噬與CKD、腎缺血再灌注等急性腎損傷、藥物性腎損害、遺傳性腎臟病、糖尿病腎病等腎臟疾病的發病及腎臟衰老有關。因此，自噬未來可能作為治療腎臟疾病的一個新靶點。益腎活血中藥腎康靈是福建省名老中醫王著礎治療腎病五十多年的臨床經驗方，具有益腎氣、行氣血、化瘀血之功效，臨床驗證療效顯著[3][4]，但其具體作用機制仍有待進一步完善。因此，本研究通過建立腺嘌呤誘導的CKD小鼠模型，觀察腎康靈對CKD小鼠腎功能和腎臟自噬水平的影響，進一步探討腎康靈CKD腎損傷的保護機制，為腎康靈在CKD中的臨床應用提供實驗依據。

一、實驗材料

（一）實驗動物

C56BL/6小鼠24只，鼠齡6～8周，體質量（22±2）g，訂購于上海吉輝實驗動物飼養有限公司，許可證號SCXK（滬）2017-0012。實驗動物均飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF級屏障系統，許可證號SYXK（閩）2019-0007。實驗過程中嚴格根據中華人民共和國科學技術部《關于善待實驗動物的指導性意見》處置實驗動物。

（二）實驗藥物

腎康靈組方為黃芪30g，生地黃15g，山茱萸9g，山藥12g，茯苓9g，牡丹皮15g，三七9g等，經煎煮、過濾、離心、濃縮至生藥濃度為1.5g/mL的藥液，由福建中醫藥大學附屬人民醫院制劑室制備。

（三）實驗試劑與儀器

腺嘌呤（A8626，美國Sigma公司）；4%多聚甲醛（BL539A，北京白鯊生物）；HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒（G1120、G1346，北京索萊寶公司）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL（P0012A、P0018S，上海碧云天生物）；封閉液、轉膜液（KGP108、KGP102，江蘇凱基生物）。RM2235石蠟切片機（德國Leica公司）；DMIL/DFC295倒置顯微鏡（德國Leica公司）；PowerPac Universal電泳儀（美國BIO-RAD公司）；ChemiDoc XRS+化學發光成像分析儀（美國BIO-RAD公司）。

二、實驗方法

（一）動物模型制備及分組給藥

24只C56BL/6小鼠，適應性喂養7天后，根據性別和體質量分層隨機化原則分為正常組、模型組和腎康靈組各8只。采用腺嘌呤誘導法[5]復制CKD小鼠模型：予模型組和腎康靈組小鼠喂食含有0.25%腺嘌呤（w/w）的飼料，正常組喂食等量普通飼料，共喂養28天，期間自由飲水。實驗第29天，腎康靈組經胃灌服腎康靈溶液1mL/100g，正常組和模型組均經胃灌服生理鹽水1mL/100g，各組連續灌胃14天。

（二）標本采集

各組小鼠末次給藥后，禁食不禁水12h，予2%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉后各小鼠予眼球摘除取血，3500rpm/min離心20min后分離上層血清，用于腎功能檢測；背部切口摘除腎組織，剝離腎外包膜后，沿冠狀面切開，取1/2右腎組織浸泡于4%多聚甲醛中用于光鏡制樣觀察，其余腎組織投入液氮速凍后轉移至-80℃保存，用于蛋白水平檢測。

（三）指標觀察與檢測

1.腎功能檢測

使用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清尿素氮（BUN）和血肌酐（Scr）的濃度。

2.腎組織病理學觀察

4%多聚甲醛固定2天，取出腎組織經乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，予4μm厚度切片，行HE染色和Masson染色，用于觀察小鼠腎組織病理形態變化。

3.Western blot法檢測腎組織自噬相關蛋白表達

RIPA裂解液提取腎組織樣本總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，各組蛋白定量后行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜后，于室溫封閉1h，4℃孵育一抗過夜，再室溫孵育二抗1h，以TBST充分洗膜，行ECL化學發光法顯影成像，以β-actin為內參，分析各目的蛋白表達水平。

（四）數據統計分析

三、實驗結果

（一）腎功能指標比較

見表1。

表1 3組小鼠BUN、Scr含量比較（n=8，±s）

表1 3組小鼠BUN、Scr含量比較（n=8，±s）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 BUN（mmol/L） Scr（μmol/L）正常組 10.91±1.39 13.24±1.91模型組 31.36±9.02▲▲ 35.81±9.79▲▲腎康靈組 12.89±1.69△△ 15.49±1.89△

（二）腎組織病理學變化

采用HE染色法觀察CKD小鼠腎臟病理變化，結果顯示，正常組小鼠腎小球和腎小管結構完整，形態均勻，未見明顯病理損傷；模型組小鼠腎小球系膜增生，腎小管管腔擴張、細胞腫脹變性；腎康靈組小鼠腎小球、腎小管病變程度較模型組明顯減輕。見圖1。

采用Masson染色法觀察CKD小鼠腎臟纖維化程度，結果顯示，正常組小鼠腎小球無明顯變化，腎小管管腔無明顯代謝物沉積，腎間質中僅有少量藍色膠原纖維呈條索狀沉積；模型組小鼠腎小球球囊明顯擴張，基底膜明顯增厚，有大片藍色膠原纖維沉積在腎小管間質及上皮；腎康靈組小鼠上述纖維化程度明顯減輕。見圖2。

圖1 各組小鼠腎組織HE染色結果（×400）

圖2 各組小鼠腎組織HE染色結果（×400）

（三）腎組織自噬相關蛋白表達水平比較

與正常組小鼠比較，模型組小鼠腎組織P62表達水平顯著降低，Atg5和LC3Ⅱ表達顯著升高（P均＜0.01）。與模型組小鼠比較，經中藥腎康靈干預后，CKD小鼠腎組織的P62表達顯著上調（P＜0.05），Atg5和LC3Ⅱ表達顯著下調（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3、表2。

圖3 各組小鼠腎組織自噬相關蛋白表達條帶圖

表2 各組小鼠腎組織自噬相關蛋白表達水平（n=5，±s）

表2 各組小鼠腎組織自噬相關蛋白表達水平（n=5，±s）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 P62/β-actin Atg5/β-actin LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ正常組 0.72±0.08 1.18±0.08 1.70±0.16模型組 0.36±0.16▲▲ 1.77±0.40▲▲ 2.37±0.22▲▲腎康靈組 0.58±0.21△ 1.36±0.19△ 1.80±0.41△△

四、討論

自噬是普遍存在于真核細胞中的一種依賴溶酶體的胞內降解系統，能夠清除細胞中損傷或衰老細胞器及生物大分子，是一種高度保守的維持自身穩態的重要調節機制。近年來越來越多研究表明，自噬參與了腎臟的疾病、修復和衰老過程。P62、Atg5和LC3Ⅱ是自噬體形成過程中的關鍵分子[6]。自噬體形成時，LC3Ⅰ轉化為LC3Ⅱ，P62蛋白則選擇性地與LC3Ⅱ直接結合并被自噬體包裹降解[7]。而自噬相關蛋白Atg5可與Atg12、Atg16L1形成多聚體，參與LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉化，從而進一步參與自噬泡雙層膜的形成[8]。

中藥腎康靈是根據CKD腎虛血瘀的病理特點而研創的臨床經驗方。研究結果表明，CKD小鼠BUN和Scr顯著升高，腎組織呈現纖維化病變，Atg5和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平明顯升高，P62蛋白水平明顯下降，提示自噬參與了CKD小鼠腎損傷的過程。經腎康靈干預治療后，CKD小鼠腎功能顯著緩解，腎組織纖維化程度減輕，Atg5和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達下降，P62蛋白表達顯著升高，提示腎康靈可能通過抑制自噬流發生，從而改善CKD腎損傷，最終延緩CKD進展。其作用機制尚需在體外實驗中進一步驗證。