不同羅非魚品系感染無乳鏈球菌后對血液和肝胰腺生化指標的影響*

敖秋桅 羅永巨 呂 敏 朱佳杰

不同羅非魚品系感染無乳鏈球菌后對血液和肝胰腺生化指標的影響*

敖秋桅 羅永巨 呂 敏 朱佳杰①

(廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院 廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室 南寧 530021)

為探究無乳鏈球菌()感染后對羅非魚的血液和肝胰腺生化指標的影響，本研究以吉富羅非魚()抗病選育系F5代、奧尼羅非魚()、吉富羅非魚“百桂”品系為對象，通過人工腹腔注射感染無乳鏈球菌，檢測感染后不同時期肝胰腺和血液中的酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)和溶菌酶(LZM)活性的變化。結(jié)果顯示，奧尼羅非魚、吉富羅非魚抗病選育系F5代和吉富羅非魚“百桂”品系的平均死亡率分別為55.4%、60.5%和78.6%，表明奧尼羅非魚抗感染能力最強；3個品系感染無乳鏈球菌后，肝胰腺組織中的ACP、AKP、SOD和T-AOC酶活力均呈先升高后下降的趨勢，其中，在感染后24 h，奧尼羅非魚的AKP和CAT酶活力顯著高于吉富羅非魚抗病選育系F5代和吉富羅非魚“百桂”品系；而感染后24 h，血清中ACP、AKP、LZM、CAT和T-AOC酶均顯著升高，而SOD酶則下降，其中，奧尼羅非魚的ACP、AKP、CAT和T-AOC酶活性明顯高于吉富羅非魚抗病選育系F5代和吉富羅非魚”百桂”品系。綜合比較6種酶在感染后不同時期的活性變化及3個品系的感染存活率，篩選出AKP和CAT作為評估羅非魚抗無乳鏈球菌感染能力強弱的指標。

羅非魚；無乳鏈球菌；免疫酶

硬骨魚類作為較低等的脊椎動物，其免疫系統(tǒng)分為非特異性免疫(Innate)和特異性免疫(Adaptive)兩種(Sasimanas, 2015)。魚類受外界抗原刺激后會進入應(yīng)激狀態(tài)，非特異免疫系統(tǒng)被激活以抵御病原菌感染。免疫應(yīng)答過程中，產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS)，刺激機體增加抗氧化酶的分泌，如過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等來清除過量的ROS。而免疫相關(guān)組織受損后導(dǎo)致ROS清除能力下降，過剩的ROS會對機體造成生物損傷及免疫力下降，繼而表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，如發(fā)炎、腫瘤等(Sifa, 2002)。因此，可以通過檢測病原菌脅迫后魚體內(nèi)血液和相關(guān)組織的生化指標來評價魚體的健康狀態(tài)。

羅非魚是聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)向全世界推廣養(yǎng)殖的優(yōu)良品種(Zhu, 2017)，也是中國水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要品種(Zhu, 2015)。近幾年，受羅非魚養(yǎng)殖規(guī)模的盲目擴大和養(yǎng)殖環(huán)境惡化等因素的影響，中國南方地區(qū)90%的羅非魚養(yǎng)殖場均不同程度暴發(fā)過無乳鏈球菌()病，感染死亡率最高可達90%(Ye, 2011; Chen, 2012)，給養(yǎng)殖從業(yè)者造成了巨大的經(jīng)濟損失，目前，尚未找到有效根治的措施。為從種源上提高羅非魚抵抗無乳鏈球菌侵染的能力，開展抗無乳鏈球菌病品種選育已刻不容緩，而篩選出羅非魚抗病性能評價指標是開展抗病育種的關(guān)鍵。目前，對羅非魚感染細菌性疾病后機體內(nèi)血清生化指標的研究已有相關(guān)報道，如Chen等(2012)等研究了羅非魚在海豚鏈球菌菌()和創(chuàng)傷弧菌()脅迫下血清生化指標的變化，Benli等(2004)研究了尼羅羅非魚()感染遲鈍愛德華菌()后的免疫相關(guān)酶的活性變化，韋現(xiàn)色等(2014)檢測了吉富羅非魚()感染無乳鏈球菌后尿素氮、肌酐含量以及肝胰腺溶菌酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和黃嘌呤氧化酶的活性變化。以上研究僅針對病原菌脅迫感染后對羅非魚機體內(nèi)免疫相關(guān)酶活性的影響，并沒有開展抗病性能評價免疫酶指標篩選的報道。

本研究對抗病力較強的奧尼羅非魚()、較易發(fā)病的吉富羅非魚“百桂”品系及經(jīng)5個世代選育后的吉富羅非魚抗病品系進行人工感染無乳鏈球菌，比較3個品系感染后的存活率、肝胰腺組織和血清中的免疫相關(guān)酶的活性變化，旨在篩選出羅非魚抗無乳鏈球菌感染能力的評價指標，為羅非魚抗病新品種選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料為吉富羅非魚抗病選育系F5代(以下簡稱抗病品系)、奧尼羅非魚(以下簡稱奧尼品系)和吉富羅非魚“百桂”品系(以下簡稱“百桂”品系)，均來源于國家級廣西南寧羅非魚良種場。選取健康有活力、規(guī)格統(tǒng)一[平均重為(56.48±0.70) g]的3個羅非魚品系各125尾，常規(guī)暫養(yǎng)8~10 d，水溫為30℃~31℃。實驗前，先用雞血平板對3個羅非魚品系(每個品系3尾魚)進行接種分離，檢測是否攜帶鏈球菌病原。

1.2 菌株來源與復(fù)蘇

實驗所用的菌株(無乳鏈球菌HN016)由本院魚病防治研究室饋贈。菌株的復(fù)蘇與培養(yǎng)參考朱佳杰等(2012)的方法，培養(yǎng)的菌液經(jīng)革蘭氏染色無雜菌后用PBS溶液將菌液稀釋至半數(shù)致死濃度1×107CFU/ml。

1.3 無乳鏈球菌感染實驗

人工腹腔注射方式感染無乳鏈球菌，每個品系注射90尾魚(30尾魚為1個重復(fù)，養(yǎng)殖容器為1 m3水桶)，每尾魚注射0.2 ml菌液。每個品系均設(shè)對照組(30尾)，注射等量PBS溶液。感染后每隔3 h觀察1次實驗魚的情況，實時記錄死魚數(shù)量，保持水質(zhì)新鮮。

1.4 樣品采集、處理與測定

無乳鏈球菌感染后，每個實驗組分別于0 h(感染實驗前)、感染后24 h取3尾魚進行尾靜脈采血，分離血清，保存于–20℃；同時，采集0 h、感染后5 h和24 h的肝胰腺組織，保存于–80℃。分別測定血清和肝胰腺組織中SOD、CAT、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)、總抗氧化能力(T-AOC)的活性。酶活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計算所得數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean±SD)表示。各組間差異使用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 無乳鏈球菌脅迫下不同羅非魚品系的死亡率統(tǒng)計

3個羅非魚品系感染后都出現(xiàn)了典型的無乳鏈球菌病癥狀，其表現(xiàn)為魚體失去平衡上下翻滾、打圈圈、鰓充血、眼球渾濁紅腫等，解剖后發(fā)現(xiàn)，肝胰腺、腎、脾明顯腫大出血、腸排空等癥狀。采用黎炯等(2010)的無乳鏈球菌PCR鑒定方法確診感染了無乳鏈球菌病。3個品系感染無乳鏈球菌后的累積死亡率如圖1所示，感染后24 h開始出現(xiàn)死魚，24~72 h為死亡高峰期，72 h后死亡魚數(shù)量逐漸趨向平穩(wěn)。抗病品系、“百桂”品系和奧尼品系的平均累積死亡率分別為60.5%、78.6%和55.4% (圖1)。

2.2 3個羅非魚品系感染無乳鏈球菌后肝胰腺組織中免疫相關(guān)酶活性的變化

由圖2A可見，感染前(0 h)，3個羅非魚品系肝胰腺組織中ACP活力的大小依次為“百桂”品系>奧尼品系>抗病品系，三者之間差異顯著(<0.05)。感染后5 h，抗病品系和奧尼品系的ACP活力顯著上升，而“百桂”品系的ACP活力顯著下降(<0.05)。感染后24 h，抗病品系和奧尼品系的ACP活力顯著下降，其中奧尼品系的ACP活力顯著低于其他品系(<0.05)。

圖1 3個羅非魚品系感染無乳鏈菌后的平均累積死亡率

同一時間點不同小寫字母表示差異顯著(<0.05)

Different lowercase letters indicate significant difference at the same time point (<0.05)

由圖2B可見，感染前(0 h)，奧尼品系肝胰腺中AKP活力顯著低于其他2個品系(<0.05)。感染后5 h，抗病品系和奧尼品系的AKP活力顯著上升(<0.05)，而“百桂”品系與感染前相比差異不顯著(>0.05)。感染后24 h，和奧尼“百桂”品系肝胰腺組織的AKP活力均顯著下降。

由圖2C可見，感染前(0 h) 3個品系肝胰腺中的CAT活力以奧尼品系的活力最高，各組間比較差異顯著(<0.05)。感染后5 h，3個品系的CAT活力均顯著下降，各組間差異顯著(<0.05)。感染后24 h，CAT的活力逐漸上升，但仍低于感染前的水平，其中，以奧尼品系的活力最高。

由圖2D可見，感染前(0 h)，抗病品系和奧尼品系肝胰腺中SOD活力顯著低于“百桂”品系(<0.05)。感染后5 h，抗病品系和奧尼品系的SOD活力顯著上升，而“百桂”品系則顯著下降(<0.05)，抗病品系和奧尼品系的SOD活力均高于“百桂”品系。感染后24 h，3個品系的SOD活力均低于感染前的水平，其中，抗病品系的活力最高。

由圖2E可見，感染前(0 h)，3個品系肝胰腺組織中T-AOC活力大小依次為抗病品系>“百桂”品系>奧尼品系，三者間差異顯著(<0.05)。感染后5 h，奧尼品系中T-AOC活力顯著上升，“百桂”品系中T-AOC活力顯著下降(<0.05)。感染后24 h，抗病和奧尼品系的T-AOC活力均顯著下降(<0.05)，其中，抗病品系的活力最高。由圖2F可見，感染前(0 h)，3個品系肝胰腺中LZM的活力大小依次為奧尼品系>抗病品系>“百桂”品系。感染后5 h，抗病選育品系的活力顯著上升(<0.05)，奧尼品系的活力則顯著下降(<0.005)，感染后24 h，抗病品系和奧尼品系均顯著下降，其LZM活力均低于感染前的水平，而“百桂”品系在感染前后均無顯著變化(>0.05)。

圖2 3個羅非魚品系感染無乳鏈球菌后肝胰腺組織免疫相關(guān)酶活力的變化

不同大寫字母表示同一品系在不同時間點有顯著差異(<0.05)；不同小寫字母表示同一時間點的不同品系有顯著差異(<0.05)。下同

Different capital letters indicate significant differences of the same strain at different time points (<0.05); Different lowercase letters indicate significant differences in different strains at the same time point (<0.05). The same as below

2.3 3個羅非魚品系感染無乳鏈球菌后血清中免疫相關(guān)酶活性的變化

3個羅非魚品系感染無乳鏈球菌后血清中免疫相關(guān)酶活性的變化見圖3。在無乳鏈球菌感染24 h后，抗病和奧尼品系的ACP和T-AOC活性均顯著上升(<0.05)，而“百桂”品系變化不顯著(>0.05)；AKP、CAT和LZM在3個品系感染24 h后均顯著上調(diào)(<0.05)，其中，AKP和CAT以奧尼品系的活性最高，LZM則以抗病品系活性最高；SOD在感染24 h后活性呈下降趨勢，抗病選育品系和奧尼羅非魚下降最明顯，這2個品系與“百桂”品系相比差異顯著(<0.05)。

圖3 3個羅非魚品系感染無乳鏈球菌前后血液中免疫相關(guān)酶活力的變化

對3個品系感染無乳鏈球菌前后肝胰腺組織和血清中6個免疫相關(guān)酶活性進行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，在感染后24 h，AKP和CAT在奧尼品系的表達量顯著高于抗病品系和奧尼品系(<0.05)，結(jié)合奧尼品系感染無乳鏈球菌后的存活率最高得出，可以通過檢測不同羅非魚個體或群體感染無乳鏈球菌后24 h AKP和CAT的表達量高低來判斷個體或群體抗病力的強弱。

3 討論

魚類屬于較低等的生物，在受到外界環(huán)境脅迫應(yīng)激時，非特異性免疫系統(tǒng)作為魚類抵抗病原的第一道屏障率先發(fā)揮作用，免疫過程會誘發(fā)魚體免疫器官釋放大量的活性氧自由基(ROS)到血液中，經(jīng)血液循環(huán)后到達各個組織，過量的ROS會對機體各個組織器官的機能造成損傷(Ardó, 2010)，從而表現(xiàn)出癥狀。無乳鏈球菌屬于革蘭氏陽性菌，是目前中國羅非魚養(yǎng)殖的首要致病菌(黎源等, 2017)，感染后的羅非魚體內(nèi)典型的病變就是肝胰腺組織腫大壞死，而肝胰腺是羅非魚機體物質(zhì)代謝的中樞器官和解毒器官 (Chen, 2011; 強俊等, 2012)。血液的生理生化是評估魚體的健康狀態(tài)的一個重要參數(shù)，可作為實時反映魚類的生理狀態(tài)變化和機體抵御抗原的有力指標(Chen, 2013; Clauss, 2008)。因此，研究羅非魚感染無乳鏈球菌后肝胰腺組織及血液中免疫相關(guān)酶活性的變化，對研制防治藥物及篩選抗病評價指標均具有重要意義。

ACP和AKP廣泛分布于動物體內(nèi)，是2種參與磷酸基團轉(zhuǎn)移和代謝的調(diào)控酶。ACP是巨噬細胞溶菌酶的特征性酶，直接參與吞噬作用，能協(xié)助殺死及吞噬病原體，還能形成水解酶體系消除異物，主要存在于魚類的肝胰腺、脾臟和血液中(Grinde, 1998)。AKP是機體解毒系統(tǒng)中的重要組成之一，在堿性環(huán)境下能水解磷酸單酯起到解毒的作用，發(fā)揮免疫防御功能(劉石林等, 2016)。高溫脅迫刺參()(劉石林等, 2016)和亞硝酸鹽脅迫草魚()(葉俊等, 2016)均顯著影響到ACP和AKP酶活力的變化。馮寧寧等(2014)研究發(fā)現(xiàn)，ACP和AKP可作為評價脊尾白蝦()抗WSSV能力的指標。本研究發(fā)現(xiàn)，在感染前抗病品系和奧尼品系肝胰腺組織的ACP和AKP酶活力均低于“百桂”品系，而感染后抗病和奧尼品系均呈先上升后下降的趨勢，這可能是感染后體內(nèi)病原菌的增殖使得肝胰腺組織通過去磷酸化應(yīng)激反應(yīng)來適應(yīng)病原菌的侵染有關(guān)，而“百桂”品系由于抵抗感染能力較弱，則處于下降趨勢。此外，3個品系感染后24 h的血清中AKP活力均呈現(xiàn)上升趨勢，這是由于肝胰腺及其他免疫器官組織因病原菌入侵釋放了大量的活性氧自由基(ROS)，這些ROS通過新陳代謝進入血液循環(huán)系統(tǒng)中，從而導(dǎo)致血清中的AKP酶活力在處于上升狀態(tài)，其中，奧尼羅非魚感染后，肝胰腺和血清中的AKP酶活性均顯著高于其他2個品系。由此暗示，通過檢測無乳鏈球菌感染后AKP酶活性高低，可作為評估羅非魚抗感染能力強弱的一個指標。

SOD是機體抗氧化的關(guān)鍵酶之一(羅勝玉等, 2017)，在清除機體活性氧自由基、輔助吞噬細胞增強殺菌功能及提高機體的免疫功能等方面起著重要作用，可作為反映機體自由基代謝和氧化損傷的重要依據(jù)，為判斷魚體的健康水平及免疫能力提供參考(徐增輝等, 2008; Zenteno-Savin, 2006)。唐保軍等(2017)研究發(fā)現(xiàn)，高鹽度脅迫黃邊糙鳥蛤()后，SOD活性呈先升高后下降的趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)，感染后5 h，抗病品系和奧尼品系肝胰腺的SOD活力顯著上升，這說明由于病原菌的侵入引起的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)很可能引起魚體內(nèi)ROS積聚，從而引發(fā)肝胰腺組織合成SOD酶的能力增強，減輕ROS對機體損傷。而感染后24 h，肝胰腺組織和血清中SOD活力均明顯下降，說明病原菌已引發(fā)相關(guān)組織損傷，導(dǎo)致機體新陳代謝和能量代謝合成各種酶的能力下降。

CAT作為機體重要的抗氧化功能酶，能夠催化過氧化氫分解，補償機體清除自由基的能力。T-AOC能反映機體抗自由基的能力(Elvitigala, 2013)。趙靜等(2015)研究發(fā)現(xiàn)，齊口裂腹魚()感染嗜水氣單胞菌()后，血清中的CAT和T-AOC呈現(xiàn)短暫上升后再下降的趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)，3個羅非魚品系感染后，血清中CAT和T-AOC活性明顯升高，表明病原菌脅迫魚后激活了機體的抗氧化系統(tǒng)，通過提高相關(guān)酶的活性來清除機體產(chǎn)生的ROS，其中，奧尼品系的活性顯著高于其他2個品系。而感染后在肝胰腺組織和血清中CAT的活性以奧尼品系最高，“百桂”品系最低。綜合比較CAT在3個品系的肝胰腺和血清中的變化，再結(jié)合它們的感染存活率，可將CAT作為評價羅非魚抗無乳鏈球菌感染能力強弱的一個生化指標。

LZM作為魚類的非特異性免疫物質(zhì)之一，主要在肝胰腺內(nèi)合成通過裂解外源性病原菌的細胞壁、糖苷鍵或酰基葡萄糖鍵來達到清除病原菌的目的，尤其對革蘭氏陽性菌有良好的殺菌作用，本研究所用無乳鏈球菌屬于革蘭氏陽性菌(Fujimoto, 2001)。本研究發(fā)現(xiàn)，抗病品系的肝胰腺組織在感染無乳鏈球菌后5~24 h，肝胰腺體組織的LZM活力呈先升高后降低的趨勢，這與溶藻弧菌()感染三疣梭子蟹() (謝建軍等, 2011)和鰻弧菌()感染中國明對蝦()(Yin, 2014)的結(jié)果相近，說明無乳鏈球菌進入羅非魚體內(nèi)后，機體提高了肝胰腺LZM的合成量并釋放到血清中。而LZM活力的提高，可增強LZM清除無乳鏈球菌的能力，提高機體的免疫抵抗力。而“百桂”品系的LZM活力在感染前后變化不明顯，這可能是該品系對無乳鏈球菌刺激在LZM的分泌上反應(yīng)不敏感，導(dǎo)致LZM活力的變化不大。

本研究分析了3個羅非魚品系感染無乳鏈球菌后肝胰腺組織和血清中SOD、CAT、ACP、AKP、LZM和T-AOC酶活性的變化，結(jié)合3個品系感染后的存活率進行關(guān)聯(lián)分析，篩選出AKP和CAT可作為評價羅非魚抗無乳鏈球菌病能力的生化指標。研究結(jié)果可為羅非魚抗無乳鏈球菌新品種選育提供參考依據(jù)。

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Effects ofInfection on Blood and Hepatopancreatic Tissue Biochemical Indices in Different Species of Tilapia

AO Qiuwei, LUO Yongju, Lü Min, ZHU Jiajie①

(Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture, Guangxi Academy of Fishery Sciences, Nanning 530021)

Nonspecific immunity plays a vital role in pathogen infection in fish. The bacteriumis an important pathogen in tilapia cultivation, but its effects on tilapia blood and hepatopancreatic biochemical indices are unclear. We injected three strains of Nile tilapia ()?a disease-resistant genetically improved farmed tilapia (GIFT) strain,a GIFT Baigui strain, and hybrid tilapia ()?with, then monitored superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), acid phosphatase (ACP), phosphatase (AKP), lysozyme (LZM), and total antioxidant capacity (T-AOC) enzyme activities in blood and hepatopancreatic tissues. Mortality rates in the hybrid tilapia, GIFT disease-resistant strain, and GIFT Baigui strain were 55.4%, 60.5%, and 78.6%, respectively. Post-infection, enzyme activities of ACP, AKP, SOD, and T-AOC in hepatopancreatic tissues of all strains changed, first increasing then decreasing, and AKP and CAT activities after 24 h of infection were significantly higher in the hybrid tilapia than in the two GIFT strains. ACP, AKP, LZM, CAT and T-AOC enzyme activities in blood increased after infection, but SOD activity decreased; ACP, AKP, CAT and T-AOC activities in the hybrid strain were significantly higher than in the two GIFT strains. Using activity changes of the six enzymes and infection mortality rates, we identified AKP and CAT as potential indicators of streptococcalresistance in strains of tilapia.

Tilapia;; Immunity enzymes

ZHU Jiajie, E-mail: 724790058@qq.com

S817.4

A

2095-9869(2020)04-0167-07

10.19663/j.issn2095-9869.20190610001

http://www.yykxjz.cn/

敖秋桅, 羅永巨, 呂敏, 朱佳杰. 不同羅非魚品系感染無乳鏈球菌后對血液和肝胰腺生化指標的影響. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2020, 41(4): 167–173

Ao QW, Luo YJ, Lü M, Zhu JJ. Effects ofinfection on blood and hepatopancreatic tissue biochemical indices in different species of tilapia. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(4): 167–173

* 國家重點研發(fā)計劃課題(2018YFD0900302-5)、廣西科技重大專項(桂科AA17204080-2)、國家特色淡水魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-46)、廣西水產(chǎn)畜牧科技推廣應(yīng)用(GXIF-2016-015)和廣西重點研發(fā)計劃項目(桂科AB16380077)共同資助 [This work was supported by the Key Research and Development Program of China (2018YFD0900302-5), Guangxi Major Projects for Science and Technology (AA17204080-2), Freshwater Fishery Industry Technology System of China (CARS-46), Guangxi Aquaculture and Husbandry of Science and Technology of Promotion of Application (GXIF-2016-015), and Guangxi Key Research and Development Program (AB16380077)]. 敖秋桅，E-mail: 179312955@qq.com

朱佳杰，副研究員，E-mail: 724790058@qq.com

2019-06-10,

2019-08-09

(編輯 馮小花)