真鯛虹彩病毒引起養(yǎng)殖斑石鯛大規(guī)模死亡的研究*

王海波 史成銀 謝國(guó)駟 劉冉陽(yáng) 任寧欣

真鯛虹彩病毒引起養(yǎng)殖斑石鯛大規(guī)模死亡的研究*

王海波1,2史成銀1①謝國(guó)駟1劉冉陽(yáng)1任寧欣1,2

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

2017年8月，山東省煙臺(tái)市某養(yǎng)殖場(chǎng)網(wǎng)箱養(yǎng)殖的斑石鯛()幼魚突然發(fā)病并大量急性死亡。疾病調(diào)查顯示，養(yǎng)殖海域水溫為26℃~28℃；病魚為4~5月齡，全長(zhǎng)為(16.3± 1.6) cm，體重為(156.9±37.0) g；80萬(wàn)尾斑石鯛幼魚2周內(nèi)累積死亡率達(dá)90%以上，經(jīng)濟(jì)損失慘重。臨診檢查發(fā)現(xiàn)，病魚體表無(wú)明顯損傷，但活力差、呼吸急促。剖檢可見病魚脾腫大、質(zhì)地脆、易碎，腎糜爛，肝有出血點(diǎn)。組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，病魚脾、腎造血組織中可見許多直徑約為20 μm的腫大細(xì)胞，腫大細(xì)胞內(nèi)含有大量直徑約為145 nm、呈六邊形的病毒顆粒。用過濾除菌的病魚脾組織勻漿液，腹腔注射感染健康斑石鯛，感染組14 d內(nèi)累積死亡率達(dá)95%。人工感染病魚表現(xiàn)出與自然發(fā)病魚類似的外觀癥狀，且在脾、腎組織切片中也可觀察到大量的腫大細(xì)胞及相似的病毒粒子。使用特異性PCR引物，從自然發(fā)病魚和人工感染病魚的肝、脾和腎組織中均檢測(cè)到魚類虹彩病毒的高強(qiáng)度感染。克隆、測(cè)序得到了1362 bp的病毒主要衣殼蛋白基因()，序列比對(duì)顯示，該病毒的序列與真鯛虹彩病毒(RSIV) RIE12-1的相應(yīng)序列完全相同。構(gòu)建的虹彩病毒系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示，該病毒屬于虹彩病毒科腫大細(xì)胞病毒屬RSIV類群，是RSIV的一個(gè)分離株。本研究首次證實(shí)RSIV可以導(dǎo)致斑石鯛大規(guī)模死亡，研究結(jié)果為診斷和防治斑石鯛病毒病提供了重要參考。

斑石鯛；真鯛虹彩病毒；腫大細(xì)胞虹彩病毒；系統(tǒng)發(fā)育樹；診斷

斑石鯛()屬溫、熱帶近海魚類，廣泛分布于中國(guó)黃海、東海、南海以及朝鮮半島、日本列島和中國(guó)臺(tái)灣等周邊海域，具有形態(tài)優(yōu)美、肉質(zhì)細(xì)膩、生長(zhǎng)速度快、當(dāng)年上市等優(yōu)點(diǎn)。2014年以來，隨著大規(guī)模人工繁育和養(yǎng)殖獲得成功，斑石鯛已成為我國(guó)名貴海水養(yǎng)殖魚類新品種之一，養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益很高(高小強(qiáng)等, 2018)。由于規(guī)模化養(yǎng)殖的時(shí)間較短，斑石鯛病害尚不多見。已報(bào)道的斑石鯛疾病主要有上皮囊腫病(Egusa, 1987; 范超等, 2017)、黏孢子蟲病(Yanagida, 2008)和卵鞭蟲病(付泉潔等, 2017)等。有學(xué)者曾經(jīng)從斑石鯛中分離到魚類神經(jīng)壞死病毒和虹彩病毒，但未見由這些病毒導(dǎo)致斑石鯛大規(guī)模死亡的報(bào)道(Skliris, 2001; Dong, 2010)。

虹彩病毒主要感染無(wú)脊椎動(dòng)物和低等脊椎動(dòng)物，屬大型二十面體狀、細(xì)胞質(zhì)型DNA病毒。虹彩病毒科(Iridoviridae)共分為5個(gè)病毒屬，即虹彩病毒屬()、綠虹彩病毒屬()、淋巴囊腫病毒屬()、蛙病毒屬()和腫大細(xì)胞病毒屬()(Jancovich, 2012)。其中，隸屬于腫大細(xì)胞病毒屬的真鯛虹彩病毒(Red sea bream iridovirus, RSIV)是魚類的重要病毒性病原之一，可導(dǎo)致真鯛()、條石鯛()、雜交石斑魚——褐龍斑(♀×♂)等海水養(yǎng)殖魚類發(fā)病并大量死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失(Inouye, 1992; 李華等, 2011; 劉冉陽(yáng)等, 2019)。真鯛虹彩病毒病一直被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為必須向其通報(bào)的魚類重要疫病，受到嚴(yán)格監(jiān)控(OIE, 2018)。

2017年8月，山東省煙臺(tái)市某養(yǎng)殖場(chǎng)網(wǎng)箱養(yǎng)殖的斑石鯛幼魚突然發(fā)病，并大量死亡，2周內(nèi)累積死亡率超過90%。本研究通過疾病調(diào)查和分子生物學(xué)分析等方法，首次證實(shí)RSIV可導(dǎo)致斑石鯛大規(guī)模死亡，研究結(jié)果為防治斑石鯛病毒病提供了重要參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用斑石鯛取自山東省煙臺(tái)市某海水魚養(yǎng)殖場(chǎng)，自然發(fā)病的斑石鯛和人工感染用健康斑石鯛全長(zhǎng)為14~18 cm，體重為150~200 g。

2216E培養(yǎng)基、弧菌選擇性培養(yǎng)基(TCBS)購(gòu)自北京陸橋生物制品有限公司；2%多聚甲醛–2.5%戊二醛固定液購(gòu)自索萊寶科技有限公司；海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，高保真ExDNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 流行情況調(diào)查及臨床癥狀檢查 疾病暴發(fā)時(shí)，深入現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查養(yǎng)殖水溫、養(yǎng)殖密度、魚齡、發(fā)病率、死亡率等情況，觀察病魚的活動(dòng)狀態(tài)。取癥狀典型的病魚，置于解剖盤中，檢查其體表癥狀，然后解剖打開腹腔，觀察體腔及各內(nèi)臟組織器官的病變情況，并做好記錄。

1.2.2 寄生蟲和細(xì)菌檢查 取病魚的鰓絲、體表黏液、內(nèi)臟器官和血液進(jìn)行寄生蟲檢查。鰓絲、體表黏液采取水浸片法，脾、腎和肝采用壓片法，血液用涂片法，制片后分別置于顯微鏡下觀察。使用75%酒精棉球?qū)Σ◆~體表消毒后，無(wú)菌條件下取病魚的肝、腎、脾等內(nèi)臟，在2216E和TCBS平板上劃線接種，28℃培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.2.3 組織病理觀察 分別取健康魚和病魚的脾、腎組織，切成小塊，置于Davidson′s AFA中固定24 h，常規(guī)石蠟切片、蘇木精–伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。將腎臟組織切成2 mm×2 mm× 2 mm的小塊，在4℃固定于2%多聚甲醛–2.5%戊二醛固定液中，在0.1 mol/L磷酸緩沖液中漂洗，再用1%鋨酸溶液固定，經(jīng)過一系列濃度的乙醇脫水，樣品塊經(jīng)環(huán)氧樹脂包埋后制備超薄切片，透射電鏡觀察、拍照。

1.2.4 人工感染 取病魚的脾組織約1 g，加入9 ml 0.9%的生理鹽水，用玻璃勻漿器在碎冰上勻漿，然后，轉(zhuǎn)移組織勻漿液到無(wú)菌50 ml離心管中。在–40℃和室溫下反復(fù)凍融3次后，4℃ 3000 r/min離心30 min。取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，收集到新的50 ml離心管中，加入10%體積的100×雙抗，充分混勻、備用。健康斑石鯛隨機(jī)分成3組，每組10尾，置于26℃~28℃的海水中養(yǎng)殖。其中，2組作為感染組，腹腔注射上述制備的病魚組織勻漿液，0.2 ml/尾；另外1組作為對(duì)照組，腹腔注射無(wú)菌生理鹽水，0.2 ml/尾。注射后，每日觀察實(shí)驗(yàn)魚的狀況、并做好記錄，持續(xù)觀察14 d以上。取瀕死實(shí)驗(yàn)魚的脾、腎等組織，一部分同1.2.3制作組織切片，另一部分提取DNA、檢測(cè)病毒。

1.2.5 樣品DNA提取 取脾、腎、肝等樣品提取組織DNA，用微量核酸測(cè)定儀(NanoDrop 2000c, Thermo, 美國(guó))測(cè)定DNA濃度和純度，稀釋至100 ng/μl備用。

1.2.6 PCR檢測(cè) 依照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《真鯛虹彩病毒病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 1675-2014)，使用引物1-F(5′-CTCAAACACTCTGGCTCATC-3′)和1-R(5′-G-CACCAACACATCTCCTATC-3′)進(jìn)行PCR檢測(cè)，目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物大小為570 bp。

25 μl PCR反應(yīng)體系：1 μl模板DNA，2.5 μl 10× Reaction buffer，2 μl Mg2+(2 mmol/L)，2 μl dNTPs(各2.5 mmol/L)，1 μl引物1-F(10 μmol/L)，1 μl引物1-R (10 μmol/L)，0.5 μl酶(5 U/μl)，15 μl超純水。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min；94℃ 30 s，58℃ 60 s，72℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán)；最后，72℃延伸5 min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查結(jié)果。

1.2.7 斑石鯛虹彩病毒主要衣殼蛋白基因的擴(kuò)增及分析 采用引物MCP-iridoF (5′-GTGCAGGTTTCC AGAAGA-3′)和MCP-iridoR (5′-CATGGTACGTAACG CATAG-3′)對(duì)虹彩病毒主要衣殼蛋白基因(Major capsid protein gene,)全長(zhǎng)序列進(jìn)行擴(kuò)增，目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物為1.6 Kb (史成銀, 2004)。

25 μl PCR反應(yīng)體系：1 μl模板DNA，2.5 μl 10× Reaction buffer，2 μl Mg2+(2 mmol/L)，2 μl dNTPs(各2.5 mmol/L)，1 μl引物MCP-iridoF (10 μmol/L), 1 μl引物MCP-iridoR (10 μmol/L), 0.5 μl Ex酶(5U/μl)，15 μl超純水。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 2 min，57℃ 1 min，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后，72℃延伸10 min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查結(jié)果。將陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，用Blast比對(duì)分析測(cè)序結(jié)果。從GenBank上下載16種虹彩病毒分離株的基因序列，連同測(cè)序得到的斑石鯛虹彩病毒基因序列，采用MEGA 7.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)與同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查及臨床癥狀檢查

2017年8月末，養(yǎng)殖海域水溫為26℃~28℃，山東省煙臺(tái)市某養(yǎng)殖場(chǎng)近海網(wǎng)箱養(yǎng)殖的斑石鯛突然發(fā)病死亡。起初個(gè)別網(wǎng)箱的斑石鯛少量死亡，但病情進(jìn)展迅速。第1天僅發(fā)現(xiàn)死魚100余尾，第2天死魚便高達(dá)6000余尾，1周內(nèi)3個(gè)最早發(fā)病網(wǎng)箱中的 30000尾魚全部死亡。養(yǎng)殖的80萬(wàn)尾幼魚發(fā)病后，日死亡率為5%~10%，2周內(nèi)累積死亡率高達(dá)90%~ 95%，損失慘重。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病斑石鯛為4~5月齡，全長(zhǎng)為(16.3±1.6) cm，體重為(156.9±37.0) g，養(yǎng)殖密度為10~15尾/m3水體。病魚體表無(wú)明顯損傷，僅表現(xiàn)為體色發(fā)黑，游動(dòng)緩慢，活力明顯下降(圖1)。解剖可見，多數(shù)病魚空胃空腸，脾、腎嚴(yán)重腫大、易碎；肝出血，膽囊充盈。其他組織器官無(wú)明顯異常。

圖1 斑石鯛病魚

2.2 寄生蟲檢測(cè)和細(xì)菌分離

經(jīng)制片和顯微觀察，所檢斑石鯛病魚均未觀察到寄生蟲。將病魚的肝、腎、脾等內(nèi)臟病料接種于2216E和TCBS平板上，28℃培養(yǎng)48 h，未見細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.3 病理切片觀察結(jié)果

在石蠟切片中，可以觀察到病魚脾、腎的造血組織中存在大量嗜堿性的、直徑達(dá)20 μm的腫大細(xì)胞，其細(xì)胞核固縮。病魚腎小管上皮細(xì)胞崩解、管腔變大；腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫大(圖2A和圖2B)。

在病魚腎組織的超薄切片中，也觀察到許多直徑約為20 μm的腫大細(xì)胞，其內(nèi)可見大量的病毒粒子 (圖3A)。病毒粒子無(wú)囊膜、直徑約為(145±5) nm，具有典型的虹彩病毒樣結(jié)構(gòu)：最外層是截面呈六邊形的病毒外殼，最內(nèi)層為高電子密度的球狀核心，在病毒外殼和核心之間為低電子密度的間隔區(qū)(圖3B)。

2.4 人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果

養(yǎng)殖水溫為26℃~28℃時(shí)，用自然發(fā)病魚的脾和腎組織勻漿液腹腔注射感染健康斑石鯛。感染后第10天開始死亡，至14 d時(shí)，感染組累積死亡率達(dá)95%，對(duì)照組未發(fā)生死亡(圖4)。人工感染病魚體色變黑、游泳無(wú)力，表現(xiàn)出與自然發(fā)病魚相似的臨床癥狀。人工感染病魚的脾和腎組織中也可見大量細(xì)胞質(zhì)嗜堿性的腫大細(xì)胞，且其內(nèi)存在大量典型的類似虹彩病毒的顆粒。人工感染病魚與自然發(fā)病魚的病理特征相似，但人工感染病魚的組織細(xì)胞病變更嚴(yán)重。

2.5 PCR檢測(cè)結(jié)果

依照中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SN/T 1675-2014)，利用合成的真鯛虹彩病毒特異性檢測(cè)引物，對(duì)所提取的斑石鯛各組織病料DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。4尾病魚的肝、脾、腎組織中均能擴(kuò)增出約570 bp的單一條帶，與目的片段大小相符(圖5)。上述結(jié)果表明，感染斑石鯛的病毒為真鯛虹彩病毒，檢測(cè)結(jié)果為強(qiáng)陽(yáng)性。

圖2 斑石鯛病魚的組織病理變化

A：脾組織中細(xì)胞質(zhì)嗜堿性的腫大細(xì)胞(箭頭)；B：腎組織中細(xì)胞質(zhì)嗜堿性的腫大細(xì)胞(箭頭)、腎小管(Rt)和腎小球(G)

A: Enlarged cells with basophilic cytoplasm (solid arrow) in the spleen tissues;B: Enlarged cells with basophilic cytoplasm (solid arrow), renal tubules (Rt) and glomerulus (G) in the kidney tissues

圖3 斑石鯛病魚腎中的腫大細(xì)胞及病毒粒子

A：腎組織中的腫大細(xì)胞(Ec)和腎小管(Rt)；B：腫大細(xì)胞內(nèi)的病毒粒子(箭頭)

A: Enlarged cell (Ec) and renal tubules (Rt) in the kidney tissues; B: Virions (solid arrow) in the enlarged cell

圖4 斑石鯛的人工感染實(shí)驗(yàn)

2.6 病毒主要衣殼蛋白基因(MCP)的擴(kuò)增與分析

使用魚類虹彩病毒特異性引物MCP-iridoF/ MCP-iridoR，從4尾病魚的肝、脾、腎組織中均擴(kuò)增得到約1.6 Kb的單一條帶，與目的片段大小相符(圖6)。測(cè)序結(jié)果顯示，各擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度均為1581 bp，且序列完全相同。經(jīng)Blast分析，該序列包含了腫大細(xì)胞虹彩病毒1362 bp的基因開放閱讀框(ORF)的全長(zhǎng)序列，及其上游57 bp和下游162 bp的序列。

將測(cè)定的1362 bp病毒基因ORF序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中16種(株)虹彩病毒的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染斑石鯛的虹彩病毒與虹彩病毒科腫大細(xì)胞病毒屬的9種(株)病毒序列相似度很高，超過94%；而與虹彩病毒科其他4個(gè)病毒屬(蛙病毒屬、淋巴囊腫病毒屬、綠虹彩病毒屬和虹彩病毒屬)的6種(株)病毒的相似度低，低于55%。因此，可以將感染斑石鯛的虹彩病毒鑒定為腫大細(xì)胞病毒屬虹彩病毒。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在腫大細(xì)胞病毒屬內(nèi)，引起此次斑石鯛大規(guī)模死亡的病毒與感染真鯛的RSIV RIE12-1、感染條石鯛的RBIV-C1、感染斜帶石斑魚的OSGIV的基因ORF序列100%相同，與分離自湛江的斑石鯛虹彩病毒的SKIV-ZJ07僅有1個(gè)核苷酸不同，相似度為99.93%。因此，將引起此次斑石鯛大規(guī)模死亡的虹彩病毒鑒定為真鯛虹彩病毒RSIV。依據(jù)基因ORF序列的多序列比對(duì)結(jié)果，采用Mega 7軟件構(gòu)建了虹彩病毒科17種(株)病毒的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，引起此次斑石鯛大規(guī)模死亡的虹彩病毒與腫大細(xì)胞病毒屬各病毒聚在一起，是RSIV的一個(gè)分離株(圖7)。

圖5 使用真鯛虹彩病毒特異性引物檢測(cè)斑石鯛病魚

M：DL2000 DNA Marker；+：陽(yáng)性對(duì)照；–：陰性對(duì)照；1~3：1號(hào)病魚肝、脾、腎；4~6：2號(hào)病魚肝、脾、腎；7~9：3號(hào)病魚肝、脾、腎；10~12：4號(hào)病魚肝、脾、腎

M: DL2000 DNA marker; +: Positive control; –: Negative control; 1~3: Sample from liver, spleen and kidney of diseased fish #1; 4~6: Sample from liver, spleen and kidney of diseased fish #2; 7~9: Sample from liver, spleen and kidney of diseased fish #3; 10~12: Sample from liver, spleen and kidney of diseased fish #4

圖6 病毒主要衣殼蛋白基因(MCP)的擴(kuò)增

M：DL2000 DNA Marker；+：陽(yáng)性對(duì)照；–：陰性對(duì)照；1~3：1號(hào)病魚肝、脾、腎；4~6：2號(hào)病魚肝、脾、腎；7~9：3號(hào)病魚肝、脾、腎；10~12：4號(hào)病魚肝、脾、腎

M: DL2000 DNA marker; +: Positive control; –: Negative control; 1~3: Sample from liver, spleen and kidney of diseased fish #1; 4~6: Sample from liver, spleen and kidney of diseased fish #2; 7~9: Sample from liver, spleen and kidney of diseased fish #3; 10~12: Sample from liver, spleen and kidney of diseased fish #4

3 討論

近年來，腫大細(xì)胞虹彩病毒病已成為魚類最主要的病毒病之一。該屬病毒可感染多種海水養(yǎng)殖魚類，如真鯛、大黃魚()、大菱鲆()、條石鯛、褐籃子魚()、眼斑擬石首魚()、尖吻鱸()、褐龍斑等(Inouye, 1992; Chen, 2003; 史成銀, 2004; 李華等, 2011; 雷燕等, 2014; 席云清等, 2018; Senapin, 2019; 劉冉陽(yáng)等, 2019)，也可感染羅非魚()、翹嘴鱖()、斑鱖()、斑馬魚()等淡水魚類(Subramaniam, 2016; 吳淑勤等, 1997; Kim, 2018; Bermúdez, 2018)，危害巨大。本研究通過疾病流行情況調(diào)查、臨床癥狀觀察、病原檢測(cè)、組織病理觀察、人工感染實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)診斷和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定2017年夏季引起養(yǎng)殖斑石鯛暴發(fā)性死亡的疾病為腫大細(xì)胞虹彩病毒病，其病原為真鯛虹彩病毒。雖已有從斑石鯛中分離到腫大細(xì)胞虹彩病毒的報(bào)道(Dong, 2010)，但本研究首次證實(shí)RSIV可以導(dǎo)致斑石鯛大規(guī)模發(fā)病死亡。

不同種類的魚感染腫大細(xì)胞虹彩病毒病后，臨床癥狀存在一定的差異。比如，大黃魚感染該病后體色發(fā)白，鰓絲極度貧血、發(fā)白且潰爛(Chen, 2003)。眼斑擬石首魚感染該病后的主要癥狀為體色變?yōu)殂y黑色，鰭基出血，鰓絲貧血并有出血點(diǎn)(席云清等, 2018)。尖吻鱸感染該病后，出現(xiàn)脫鱗、鰭腐爛、腹部損傷、皮膚發(fā)紅出血等癥狀(Senapin, 2019)。翹嘴鱖感染腫大細(xì)胞虹彩病毒后，鰓、肝蒼白，內(nèi)臟局部充血(吳淑勤等, 1997)。本研究發(fā)現(xiàn)，斑石鯛感染該病后，體色變暗、游動(dòng)無(wú)力，但體表并沒有明顯的出血或者潰爛等癥狀，與大菱鲆感染該病后的癥狀相似(史成銀, 2004)。因此，僅從外觀癥狀上很難診斷斑石鯛虹彩病毒病，必須借助于病原檢測(cè)技術(shù)才能對(duì)斑石鯛虹彩病毒病進(jìn)行準(zhǔn)確診斷。

組織病理學(xué)研究表明，魚類腫大細(xì)胞虹彩病毒病最重要的特征是脾和腎等靶器官中存在腫大細(xì)胞，腫大細(xì)胞內(nèi)含有大量的虹彩病毒粒子(Inouye, 1992; 史成銀, 2004)。本研究在斑石鯛病魚的脾和腎組織中也發(fā)現(xiàn)了大量的細(xì)胞質(zhì)嗜堿性的腫大細(xì)胞，這些腫大細(xì)胞內(nèi)存在大量直徑約為145 nm的虹彩病毒粒子。而且，與自然發(fā)病魚相比，人工感染斑石鯛的脾和腎組織中存在更多的腫大細(xì)胞，組織病變也更嚴(yán)重。疾病調(diào)查和人工感染實(shí)驗(yàn)都顯示，斑石鯛是真鯛虹彩病毒的易感宿主，病魚的組織病理變化廣泛且嚴(yán)重。

圖7 依據(jù)MCP基因ORF序列構(gòu)建的17種(株)虹彩病毒系統(tǒng)發(fā)育樹

本研究通過病毒基因ORF序列的測(cè)定和虹彩病毒系統(tǒng)發(fā)育分析，將導(dǎo)致此次斑石鯛暴發(fā)性死亡的病毒鑒定為真鯛虹彩病毒。值得注意的是，該養(yǎng)殖場(chǎng)的褐龍斑此前曾暴發(fā)過真鯛虹彩病毒病(劉冉陽(yáng)等, 2019)。經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，感染斑石鯛和褐龍斑的虹彩病毒基因序列100%相同，表明它們是同一種病毒。因此，該養(yǎng)殖場(chǎng)不同品種的養(yǎng)殖魚類之間很可能存在病原交叉感染。因此，在生產(chǎn)中各養(yǎng)殖車間要嚴(yán)格執(zhí)行消毒和隔離制度，通過檢測(cè)、檢疫防止病原侵入，采取生物安保措施防范虹彩病毒病的發(fā)生和蔓延。

斑石鯛虹彩病毒病一旦暴發(fā)就難以控制，幼魚 2周內(nèi)累積死亡率高達(dá)90%以上，危害嚴(yán)重。在斑石鯛的規(guī)模化養(yǎng)殖過程中必須對(duì)該病高度重視，采取有效措施控制疾病的發(fā)生和蔓延。

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Red Seabream Iridovirus Causing Mass Mortality in Farmed Spotted Knifejaw,

WANG Haibo1,2, SHI Chengyin1①, XIE Guosi1, LIU Ranyang1, REN Ningxin1,2

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao); Qingdao Key Laboratory of Mariculture Epidemiology and Biosecurity, Qingdao 266071; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)

Spotted knifejaw () is a new species of mariculture fish with high economic value in China. In August 2017, an outbreak of unknown etiology occurred in spotted knifejaw juveniles cultured in the offshore cages of a marine fish farm. Investigation showed that the water temperature was 26℃~28℃ and that the infected fish were mainly juveniles at the age of 4~5 months. The total length of the diseased fish was (16.3±1.6) cm and their body weight was (156.9±37.0) g. The cumulative mortality of 800000 juveniles was more than 90% within 2 weeks of disease onset. Clinical examination showed that the diseased juveniles had no obvious apparent lesions but had poor vitality and rapid breathing. Necropsy findings included a swollen and brittle spleen, kidney erosion, and hemorrhagic spots in the liver. No parasites were detected, and no pathogenic bacteria were isolated from the liver, spleen, and kidney of the diseased fish. Histopathological sections showed a large number of enlarged cells (about 20 μm in diameter) in the spleen and kidney tissues of diseased fish. In addition, a large number of hexagonal virus particles with a diameter of about 145 nm were observed in the electron microscope sections of the spleen and the body kidney. The spleen homogenate of naturally infected fish was filtered and injected intraperitoneally into healthy fish at a water temperature of 26℃. The fish in the infected group began to die after 10 days post infection (dpi), and the cumulative mortality reached 95% within 14 dpi. Artificially infected fish showed symptoms similar to those in naturally infected fish, and a large number of enlarged cells and similar virus particles could be observed in the spleen and kidney tissue sections. Severe iridovirus infection was detected in the spleen and kidney tissues of naturally and artificially infected fish using specific PCR primers. The major capsid protein gene () of the iridovirus, at 1362 bp in length was cloned and sequenced, and the phylogenetic tree of the family Iridoviridae was constructed. The results showed that the virus belonged to the red sea bream iridovirus (RSIV) of genusin the family Iridoviridae. Based on the results of epidemiological investigation, clinical symptom observation, etiological detection, histopathological observation, artificial infection experiments, molecular biology diagnosis, and viral phylogenetic analysis, it was confirmed that the disease causing the mass death of spotted knifejaw wasdisease, and that the pathogen was a strain of RSIV. This study demonstrates for the first time that RSIV can cause large-scale death in the spotted knifejaw. Furthermore, the research results provide an important reference to diagnose and control viral diseases in the spotted knifejaw.

; Red sea bream iridovirus (RSIV);; Phylogenetic tree; Diagnosis

SHI Chengyin, E-mail: shicy@ysfri.ac.cn

S942.2

A

2095-9869(2020)04-0151-08

10.19663/j.issn2095-9869.20190430001

http://www.yykxjz.cn/

王海波, 史成銀, 謝國(guó)駟, 劉冉陽(yáng), 任寧欣. 真鯛虹彩病毒引起養(yǎng)殖斑石鯛大規(guī)模死亡的研究. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(4): 151–158

Wang HB, Shi CY, Xie GS, Liu RY, Ren NX. Red seabream iridovirus causing mass mortality in farmed spotted knifejaw,. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(4): 151–158

* 農(nóng)業(yè)國(guó)際交流與合作項(xiàng)目和中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(2017HY-ZD0303) 共同資助 [This work was supported by Projects of International Exchange and Cooperation in Agriculture, Ministry of Agriculture and Rural Affairs of China, and Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2017HY-ZD0303)]. 王海波，E-mail: qqwang1768510759@163.com

史成銀，研究員，E-mail: shicy@ysfri.ac.cn

2019-04-30,

2019-05-09

(編輯 馬璀艷)