應用D-異抗壞血酸鈉分光光度法快速檢測血清百草枯含量在臨床的意義＊

胡卡利 ，陳曉兵 ，李小民 △，王 麗 ，劉 華 ，沙 鷗

（1.江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013；2.南京醫科大學康達學院第一附屬醫院檢驗科，江蘇 連云港222000；3.南京醫科大學康達學院第一附屬醫院急診科，江蘇連云港222000；4.江蘇龍燈化學有限公司，江蘇 連云港222000；5.江蘇海洋大學化學工程學院，江蘇 連云港222000）

百草枯中毒是我國農藥中毒死亡率較高的疾病之一，百草枯中毒死亡率與中毒劑量、洗胃時間長短等多種綜合因素有關[1]，目前臨床檢測百草枯的方法沒有統一標準，各級醫院檢測方法各不相同，百草枯中毒又多發生在農村等基層醫療機構，如何快速有效、經濟、簡便的臨床預判，一直是基層醫院所面臨的一大難題，前期，我們建立以一種新的檢測方法，檢測尿中百草枯的濃度[2]，由于受患者排尿的影響，測定尿中百草枯濃度有一定時間延遲性，為方便快速的檢測血中百草枯濃度，為此，我們建立了一種快速簡潔的測定方法，并應用于臨床，現總結如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象均來自南京醫科大學康達學院第一附屬醫院急診科2014年1月至2017年12月收治的40例百草枯中毒患者，均為主訴口服百草枯，女性 30 例，年齡 36.0（22.4～49.3）歲，男 性 10 例，年齡30.0（21.0～52.6）歲；所有患者均為口服百草枯30min以后來院就診。患者入院后常規徹底洗胃、導泄等基本處理，依據《百草枯中毒診斷與治療“泰山共識”》[3]，均予以目標導向性血液灌流等標準治療[4]，依據患者存活情況，分為死亡組25例、存活組15例。納入患者：口服、就診時間＜24h者。排除患者：①既往有嚴重心、肝、腎、呼吸系統等疾病病史者；②就診時間＞24h者；3.48h內死亡者。

1.2 儀器及試劑

TU-1901型分光儀（北京普析），百草枯（中國藥品生物制品檢測所，含量為99.0%），百草枯儲備液（濃度1g/L，臨用時逐級稀釋），6mol/L的NaOH溶液；D-異抗壞血酸鈉（含量98%）。

1.3 實驗方法

量取0.1～1.0 mL濃度100 μg/L百草枯標準品液于5mL的比色管中，依次加入0.2mL、6.0mol/L NaOH溶液，0.5mL、24.84g/LD-異抗壞血酸鈉溶液，用雙蒸水稀釋至刻度線，搖勻。以試劑空白做參比，采用TU-1901雙光束紫外分光光度儀，測定604nm處的吸光度，方法同前期檢測尿中百草枯的濃度[2]。

1.4 標本采集及保存

本研究中血清均由南京醫科大學康達學院第一附屬醫院急診科提供，包括健康人體血清與百草枯中毒患者血清，健康人體血清樣本中加入標準百草枯溶液，作為對照。

2 結果

2.1 波長的選擇

在（300～800）nm 波長內對百草枯、D-異抗壞血酸鈉，以及百草枯+D-異抗壞血酸鈉+NaOH進行光譜測定如圖1所示，以相應試劑作空白對照，實驗表明，在往待測定的百草枯溶液中加入D-異抗壞血酸鈉和NaOH后，呈現藍色反應，并在395和604nm波長處有兩處吸收峰，在395nm波長處有最大峰值，但在該波長下，其他物質干擾大、吸光度不穩定；604nm處又一吸收峰，該峰值穩定、無干擾。本實驗選擇604nm作為波長選擇。

圖1 吸收曲線

2.2 NaOH用量選擇

實驗結果表明，伴隨NaOH用量的增加，吸光度亦隨之增加，當6mol/LNaOH用量在0.15～0.5mL時，吸光度達到最大，且穩定，故實驗選擇0.2mL，質量濃度為6mol/L的NaOH溶液。

2.3 反應時間選擇

實驗結果表明，吸光度在4min后穩定，20min內保持不變；20min后逐步降低。因此，選擇反應后4min進行測定，20min內測完。

2.4 回歸方程的制定

配比不同質量濃度的百草枯溶液，按照實驗方法，測定吸光度。實驗表明，百草枯濃度在0.5～20.0mg/L范圍內，與吸光度A有良好的正相關線性，線性回歸方程 A=0.03897C+0.02408（mg/L）；線性相關系數R=0.997；表觀摩爾吸光系數ε=1.01×104L/(mol·cm)。

2.5 干擾實驗

本實驗控制誤差在（±5%），百草枯濃度固定為5mg/L，測定常規正負離子對實驗結果的影響。結果顯示：在 500 倍的（K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Sn2+、SO42-、Br-、NO3-）；250 倍的（Pb2+）；20 倍的（Ca2+、Ni2+）及 5 倍的（Fe3+、Cu2+）等離子均不影響測定結果。

2.6 中毒患者血清百草枯濃度

我們所測定的40例患者中，有3例測定濃度小于最低測定濃度0.3ug/mL，40例中毒患者，其中存活組15例、死亡組25例，檢測其血清百草枯濃度（表1），測定結果表明，存活組濃度明顯較死亡組低，差異有統計學意義，隨著測定濃度的增加，死亡率也逐漸增加，兩者呈正相關性，相關系數rp=0.842。

表1 百草枯中毒患者血清濃度

3 討論

D-異抗壞血酸鈉有較強的還原性，本研究利用其在堿性條件下百草枯能與D-異抗壞血酸鈉生成藍色自由基的化學反應特性，采用比色法來檢測血中百草枯濃度，系統的摸索出了D-異抗壞血酸鈉、氫氧化鈉用量以及顯色時間等因素影響關系[2]，在最佳條件下，對血清百草枯的濃度進行了檢測，并將實驗測定結果應用于臨床，我們發現此方法與傳統的連二亞硫酸鈉法測定方法進行對比，該方法能消除血漿本身顏色因素對測定結果的影響，測定結果的靈敏度高，檢測極限可達0.1μg/mL。

雖然國家對百草枯禁售的施行，但一些新型摻售原始的百草枯的農藥依舊不絕，這給臨床工作初期帶來困惑，在輕、中度中毒患者中，初期臨床癥狀不十分明顯，在不十分肯定是否為百草枯中毒時，利用本方法可以測定出低劑量的百草枯含量，為臨床工作帶來理論依據。我們在實際40例的臨床檢測過程中發現，存活組血清濃度明顯較死亡組低，差異有統計學意義，隨著測定濃度的增加，死亡率也逐漸增加，血清濃度與死亡率呈正相關性。這也為重度中毒患者提供了重要臨床決策方案。

目前，百草枯的分析檢測方法主要有色譜法、分光光度測定法、氣相色譜法、液相色譜法及毛細管電泳法和質譜聯用法等[5-9]。氣相色譜法操作比較復雜；質譜聯用檢測儀器、設備昂貴，技術難度高，難推廣應用；毛細管電泳技術耗時長[10]。這幾類檢測方法均不適合基層醫院。D-異抗壞血酸鈉測定法所需設備簡單、原材料來源廣泛、測定程序少、方法簡便、結果靈敏可靠、穩定。同時還可以測定尿中百草枯中毒含量[2]，值得在基層醫院推廣。