靜電紡絲法制備ZnO構(gòu)建酪氨酸酶生物傳感器檢測(cè)鄰苯二酚

李純，孫麗霞，孫建華，周利琴，徐大鵬，張友全，廖丹葵

（廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西石化資源加工及過程強(qiáng)化技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530004）

近年來，中國(guó)化工行業(yè)的迅速崛起提升了人們的生活水平，但與此同時(shí)也使得中國(guó)水資源污染問題越來越嚴(yán)重。以酚類物質(zhì)為例，它對(duì)人體、動(dòng)植物具有較大毒性，如鄰苯二酚會(huì)抑制中樞系統(tǒng)，干擾白細(xì)胞DNA的合成，當(dāng)其處于0.1～0.2mg/L范圍時(shí)，魚肉會(huì)存在異味，高濃度含酚廢水會(huì)使農(nóng)作物枯死、減產(chǎn)[1]；而煉油、煉焦等工業(yè)生產(chǎn)過程所產(chǎn)生的廢水中均含有酚類物質(zhì)，如何快速準(zhǔn)確檢測(cè)工業(yè)廢水是否達(dá)到國(guó)家排放要求也成為了研究的熱門領(lǐng)域。

電化學(xué)生物傳感器在生物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)和工業(yè)領(lǐng)域變得越來越重要。酪氨酸酶生物傳感器中的酪氨酸酶被稱作酚類氧化酶，由于其具有簡(jiǎn)單、高選擇性和成本相對(duì)較低的優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛研究，且已被廣泛用于酚類化合物的檢測(cè)[2-3]。針對(duì)生物傳感器，酶在合適基質(zhì)上負(fù)載及其穩(wěn)定性是保證生物傳感器具有優(yōu)異性能的重要因素。酶可通過物理吸附、交聯(lián)、自組裝、加入碳糊、聚合物和溶膠凝膠等多種方法實(shí)現(xiàn)酶的固定化；另一方面，納米結(jié)構(gòu)載體由于具有較高的比表面積、較高的酶載量、理想的微環(huán)境以及酶活性位點(diǎn)與電極之間可直接電子轉(zhuǎn)移的優(yōu)點(diǎn)，能很好地保持其生物活性[4]，利用二氧化鈦（TiO2）、碳納米管和ZrO2/殼聚糖等載體制備酪氨酸酶生物傳感器均有報(bào)道[5-7]。氧化鋅（ZnO）由于具有較高的等電位點(diǎn)（IEP，約為9.5）而適宜于吸附等電位點(diǎn)低的蛋白質(zhì)，同時(shí)ZnO的生物相容性較好，因此以此為載體負(fù)載酶對(duì)保持酶活性具有積極作用。由于微納米纖維材料的大比表面積可有效地提高生物傳感器的性能，而大規(guī)模制備ZnO 微納米纖維，靜電紡絲是最有效的技術(shù)[8]。因此，本文采用靜電紡絲技術(shù)合成了ZnO 微納米纖維，并研究了該材料制備酪氨酸酶生物傳感器檢測(cè)鄰苯二酚，期待制備一種方便高效的生物傳感元件。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

玻碳電極、Ag/AgCl 電極、鉑片電極，中國(guó)武漢高仕睿聯(lián)科技有限公司；酪氨酸酶（酶活力7164U/mg），德國(guó)Sigma Aldrich 公司；聚乙烯吡咯烷酮（PVP，K88-96），上海阿拉丁試劑有限公司；乙酸鋅，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N,N-二甲基甲酰胺（DMF），天津富宇精細(xì)化工有限公司；殼聚糖（CS），浙江金殼生物化學(xué)有限公司；多巴胺、鄰苯二酚、葡萄糖、尿素，上海麥克林生化科技有限公司。

靜電紡絲機(jī)，E02型，廣東佛山輕子精密測(cè)控技術(shù)有限公司；電化學(xué)工作站，IviumStat型，荷蘭Ivium Technology 公司；馬弗爐，L40/12 型，德國(guó)Nabertherm 公司；X 射線雙晶粉末衍射儀（XRD），RIGAKU型，日本株式會(huì)社理學(xué)公司；掃描電子顯微鏡（SEM），S-3400N型，日本日立公司。

1.2 ZnO微納米纖維的制備

稱取1.1478g PVP 溶于5mL DMF 溶劑，稱取1.5000g 乙酸鋅溶于5mL 純水，待兩溶液充分混合并在密封條件下攪拌12h即得所需紡絲液。將紡絲液注入針管中，針頭與接收鼓前端的距離為17cm，設(shè)置正負(fù)電壓差約為16kV，紡絲速率為0.6mL/h，設(shè)置完成后進(jìn)行紡絲操作得ZnO前體。

將ZnO前體置于馬弗爐中進(jìn)行煅燒，煅燒時(shí)升溫速率設(shè)置為1℃/min，升溫至650℃后保溫2h 得到ZnO微納米纖維。

1.3 Tyr/ZnO/CS/GCE工作電極的制備

將玻碳電極用Al2O3拋光粉反復(fù)打磨并用水沖洗干凈，按照水、乙醇∶水=1∶1、水、硝酸∶水=1∶1、水的順序?qū)﹄姌O進(jìn)行超聲處理直至電極表面呈鏡面狀。再用1mol/L H2SO4溶液對(duì)玻碳電極進(jìn)行電化學(xué)清洗，當(dāng)電極在5.0mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6（1∶1）溶液中（含0.1mol/L KCl）的CV 曲線氧化峰與還原峰差值在100mV 以內(nèi)后即可清洗保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取一定質(zhì)量ZnO加入超純水中得到樣液，分別量取樣液和0.3mg/mL的酪氨酸酶溶液各10μL充分混合后滴加在處理過的玻碳電極上，再滴加7μL濃度為2mg/mL 的CS 溶液，置于4℃條件下干燥一夜即得Tyr/ZnO/CS/GCE工作電極。

1.4 結(jié)構(gòu)與形貌表征

采用SEM 觀察所制材料的微觀形貌，采用XRD表征材料的晶型結(jié)構(gòu)。

1.5 電化學(xué)測(cè)試

實(shí)驗(yàn)采用三電極體系，對(duì)電極采用鉑片電極，參比電極采用Ag/AgCl 電極，工作電極為自制Tyr/ZnO/CS/GCE 電極，采用IviumStat 型電化學(xué)工作站進(jìn)行性能測(cè)試。采用CV 在氧化還原探針為5.0 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6（1∶1） 溶 液（含0.1mol/L KCl），掃描范圍為-0.4～0.8V 條件下進(jìn)行不同掃描速率下CV測(cè)試，采用交流阻抗法（EIS）對(duì)不同工作電極進(jìn)行EIS測(cè)試；工作電勢(shì)設(shè)為-0.2V，采用計(jì)時(shí)電流法在不同濃度鄰苯二酚溶液中進(jìn)行IT 測(cè)試，利用公式LOD=3σ/S 計(jì)算最低檢測(cè)限（LOD），其中σ為未加鄰苯二酚時(shí)電流值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（10 次重復(fù)），S 為校準(zhǔn)曲線的斜率（實(shí)驗(yàn)過程見圖1）。

圖1 實(shí)驗(yàn)過程示意圖

2 結(jié)果與討論

2.1 ZnO形貌及結(jié)構(gòu)表征

圖2(a)為煅燒后ZnO的SEM圖，可知煅燒后材料整體仍保持粗細(xì)均勻的纖維狀，纖維直徑約為400nm，且該纖維表面不光滑，由近似球狀的顆粒連接而成，原因是在制備時(shí)未加入表面活化劑，導(dǎo)致表面張力過大使納米纖維轉(zhuǎn)化為珠狀顆粒[9]，這為酶的附著提供了更多的附著位點(diǎn)[10-11]。圖2(b)為Tyr/ZnO/CS電極材料的SEM圖，可知酪氨酸酶可附著在納米纖維之間空隙中，且仍可基本保持ZnO的纖維形貌。

從圖2(c)煅燒后ZnO材料的XRD圖及其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)卡片比較可知，ZnO為六方晶系，其主衍射峰可完全與ZnO標(biāo)準(zhǔn)卡片對(duì)應(yīng)，說明靜電紡絲法所制前體經(jīng)過煅燒后可合成高純度的ZnO微納米纖維。

2.2 Tyr/ZnO/CS/GCE工作電極電化學(xué)性能檢測(cè)

圖3為Tyr/ZnO/CS/GCE工作電極在不同掃描速率下測(cè)得的CV 曲線及峰電流與掃描速率平方根的關(guān)系曲線。該電極有明顯的氧化還原峰，對(duì)比發(fā)現(xiàn)基于電化學(xué)沉積法制備的ZnO生物傳感電極在相同測(cè)試條件下氧化還原峰峰電流值與本試驗(yàn)結(jié)果基本接近，說明Tyr/ZnO/CS/GCE 工作電極具有較好的直接電子傳輸能力[12]。而圖3(b)工作電極氧化和還原峰峰電流值與掃描速率平方根的線性關(guān)系表明該工作電極在反應(yīng)時(shí)控制步驟為擴(kuò)散控制[13-14]。

2.3 工作電極性能測(cè)試條件優(yōu)化

2.3.1 pH對(duì)工作電極性能的影響

圖2 ZnO形貌及結(jié)構(gòu)圖

電解液pH 會(huì)影響電極性能，當(dāng)酶活性大時(shí)，底物鄰苯二酚單位時(shí)間被氧化還原的量增大，表現(xiàn)為工作電極的電信號(hào)增強(qiáng)。將工作電極置于不同pH的1mmol/L 鄰苯二酚溶液中進(jìn)行CV測(cè)試，結(jié)果見圖4。由圖可知，還原峰峰電流響應(yīng)值在pH=5～7.5 范圍先增大后減小，在pH=5.5 時(shí)電流響應(yīng)值最大為-19.97μA，這是因?yàn)槔野彼崦冈谒嵝詶l件下活性更好[15]，因此使得還原峰峰電流響應(yīng)值在酸性條件下更大。

圖3 Tyr/ZnO/CS/GCE工作電極的電化學(xué)性能圖

2.3.2 ZnO添加量對(duì)工作電極性能的影響

固定化酶載體量會(huì)對(duì)電流響應(yīng)產(chǎn)生影響，考察了ZnO 負(fù)載酪氨酸酶的工作電極對(duì)應(yīng)CV 曲線中還原峰峰電流響應(yīng)值的變化情況，如圖5 所示。在-0.4～0.8V 的掃描范圍內(nèi)，ZnO 濃度為3mg/mL 時(shí)還原峰峰電流響應(yīng)值最大為-22.20μA，當(dāng)ZnO 濃度過大時(shí)峰電流值反而減小，這是由于ZnO添加量過多會(huì)增加電流阻力，從而導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)移能力下降[16]；而當(dāng)ZnO濃度過小時(shí)酪氨酸酶分子在載體表面可能形成擁擠并增大對(duì)擴(kuò)散過程的限制程度，這會(huì)使還原峰峰電流值減小[17]。

2.3.3 溫度對(duì)工作電極性能的影響

溫度是影響電極性能的重要因素，底物鄰苯二酚單位時(shí)間被氧化還原的量增大，表現(xiàn)為工作電極的傳感信號(hào)增強(qiáng)，圖6為不同溫度對(duì)工作電極傳感性能的影響曲線，由圖可知，工作電極在20～35℃溫度范圍內(nèi)可保持較大的穩(wěn)態(tài)電流差值，當(dāng)溫度高于35℃時(shí)穩(wěn)態(tài)電流差值降低較快，這可能是由于溫度升高會(huì)改變酪氨酸酶構(gòu)象，影響酪氨酸酶活性，進(jìn)而使穩(wěn)態(tài)電流差值降低[18]。

圖4 工作電極在不同pH下還原峰電流測(cè)試結(jié)果

圖5 工作電極在不同ZnO添加量下還原峰電流測(cè)試結(jié)果

圖6 工作電極在不同溫度下穩(wěn)態(tài)電流差值測(cè)試結(jié)果

2.4 工作電極傳感性能檢測(cè)

在上述優(yōu)化條件下采用計(jì)時(shí)電流法以Tyr/ZnO/CS/GCE 為工作電極檢測(cè)鄰苯二酚。在電解液中先滴加2.5μmol/L鄰苯二酚溶液，再連續(xù)滴加5μmol/L鄰苯二酚溶液得到計(jì)時(shí)電流曲線見圖7(a)。由圖7(a)可知，即使加入微量的鄰苯二酚也能引起響應(yīng)電流的快速增大，且達(dá)到穩(wěn)定電流所需時(shí)間小于5s，表明該修飾電極對(duì)鄰苯二酚有良好的催化能力，但超過該電極的檢測(cè)范圍后電流值將不再繼續(xù)變化。不同鄰苯二酚濃度與對(duì)應(yīng)電流值的擬合結(jié)果見圖7(b)，該方法檢測(cè)鄰苯二酚的線性檢測(cè)范圍為5～50 μmol/L，傳感元件靈敏度為376.31μA/(mmol·L·cm2)，最低檢測(cè)限為1.9041μmol/L。

表1為部分電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)酚類物質(zhì)時(shí)的效果，純ZnO無酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)范圍較窄且靈敏度不大，而還原氧化石墨烯（rGO）的加入會(huì)極大地提高傳感元件的靈敏度[19-20]。對(duì)于酪氨酸酶生物傳感器，以1-乙烯基-3-乙基咪唑溴化銨（ViEtIm+Br-）聚合物微粒為載體的傳感元件適用于檢測(cè)高濃度酚類物質(zhì)[21]，而以2-羥基苯甲酰胺（2-HBZ）為載體的傳感元件適用于檢測(cè)極低濃度酚類物質(zhì)[22]。相比于氣相傳輸法制備的Tyr/ZnO-NR/GCE 電極，利用靜電紡絲法制備的Tyr/ZnO/CS/GCE 電極檢測(cè)限和靈敏度均有一定改善[23]，且靜電紡絲法適用于大規(guī)模制備，因此該電極在檢測(cè)酚類物質(zhì)時(shí)有一定優(yōu)勢(shì)。

圖7 傳感性能分析圖

2.5 ZnO對(duì)工作電極傳感性能的影響

為研究ZnO對(duì)工作電極傳感性能的影響，比較了Tyr/ZnO/CS/GCE 電極和Tyr/CS/GCE 電極在相同體系中的傳感性能。Tyr/CS/GCE 電極IT 測(cè)試結(jié)果見圖8，該電極在檢測(cè)鄰苯二酚時(shí)檢測(cè)范圍為5～40μmol/L，靈敏度為856.80μA/(mmol·L·cm2)。與Tyr/ZnO/CS/GCE 電極IT 測(cè)試結(jié)果對(duì)比，Tyr/ZnO/CS/GCE 電極的檢測(cè)范圍比Tyr/CS/GCE 電極更寬，但靈敏度稍低于Tyr/CS/GCE 電極，這可能是由于ZnO 導(dǎo)電性較差的原因[圖8(c)][4]。同時(shí)，Tyr/ZnO/CS/GCE 電極穩(wěn)態(tài)電流值在鄰苯二酚濃度超過65μmol/L 后趨于平穩(wěn)，且不會(huì)衰減，而Tyr/CS/GCE電極穩(wěn)態(tài)電流值在鄰苯二酚濃度超過50μmol/L后逐漸下降，本文作者認(rèn)為是由于酪氨酸酶活性降低導(dǎo)致穩(wěn)態(tài)電流值減弱，由此認(rèn)為ZnO 微納米纖維材料可使酪氨酸酶更穩(wěn)定[24]。

圖8 ZnO對(duì)工作電極傳感性能的影響及導(dǎo)電性對(duì)比分析圖

2.6 Tyr/ZnO/CS/GCE 電極抗干擾性和循環(huán)穩(wěn)定性測(cè)試

選取尿素、多巴胺和葡萄糖這3種電化學(xué)活性相近的物質(zhì)進(jìn)行Tyr/ZnO/CS/GCE 電極抗干擾性測(cè)試，結(jié)果見圖9(a)。每次加入5μmol/L鄰苯二酚后，電流值均會(huì)發(fā)生明顯變化，可斷定該電極會(huì)對(duì)鄰苯二酚產(chǎn)生響應(yīng)。當(dāng)分別加入5μmol/L葡萄糖、尿素和多巴胺時(shí)，電流值只產(chǎn)生了微小波動(dòng)[圖9(b)]，其中，加入葡萄糖對(duì)檢測(cè)鄰苯二酚過程的干擾影響最大，但其電流變化量也僅為加入鄰苯二酚時(shí)的4.9%，由此可認(rèn)為該工作電極使這3種物質(zhì)對(duì)檢測(cè)鄰苯二酚的傳感過程干擾很小，表明該電極具有良好的抗干擾性。通過對(duì)Tyr/ZnO/CS/GCE 電極進(jìn)行循環(huán)穩(wěn)定性測(cè)試發(fā)現(xiàn)，該電極在15 天后可保持初次測(cè)試性能的91%，30 天后仍可保持原性能的82%，表明該電極循環(huán)穩(wěn)定性良好[25]。

圖9 Tyr/ZnO/CS/GCE電極抗干擾性結(jié)果

3 結(jié)論

利用靜電紡絲法制備了由近似球狀的顆粒連接而成的ZnO微納米纖維材料。利用該ZnO微納米纖維材料構(gòu)建了Tyr 生物傳感器用于檢測(cè)鄰苯二酚，在優(yōu)化檢測(cè)條件下，Tyr/ZnO/CS/GCE 電極對(duì)鄰苯二酚的檢測(cè)范圍為5～50μmol/L，檢測(cè)限為1.9041 μmol/L，靈敏度為376.31μA/(mmol·L·cm2)，在加入尿素、多巴胺和葡萄糖這3種電化學(xué)活性相近物質(zhì)的情況下仍能表現(xiàn)出很好的抗干擾性，且循環(huán)穩(wěn)定性良好。因此，該生物傳感器經(jīng)過進(jìn)一步改性后有望被視為潛在的工業(yè)廢水中酚類物質(zhì)含量檢測(cè)方法。