蓋子環替換及定點突變提高菜豆環氧化物水解酶對鄰甲基苯基縮水甘油醚的催化性能

章晨，朱秀秀，李闖，鄔敏辰

（1 江南大學藥學院，江蘇無錫214122；2 江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122；3 江南大學無錫醫學院，江蘇無錫214122）

手性環氧化物是一類重要的藥物砌塊，廣泛運用于醫藥、農藥等領域[1]。如(S)-環氧苯乙烷是合成抗HIV 病毒藥、殺蟲劑等的重要中間體[2]；(R)-oMGE 是合成β1-腎上腺素受體拮抗劑的重要原材料[3]。目前主要是通過化學合成以及生物酶催化拆分外消旋（racemic,rac-）環氧化物來獲取單構型的環氧化物。化學合成中會使用大量的重金屬，不僅在生產中毒害大，也會對環境造成極大的破壞。相比之下，生物酶法由于其低毒性和經濟性，被廣泛接受[4]。如環氧化物水解酶（epoxide hydrolases,EH,EC 3.3.2.-），能夠催化外消旋環氧化物對映或歸一性水解為相應的鄰二醇，且廣泛存在于植物、動物以及微生物體內[5]。

近年來，環氧化物水解酶的挖掘及改造已成為研究熱點。如許建和團隊[6-7]從綠豆中擴增出2條編碼EH 的基因，并導入大腸桿菌（Escherchia coli，E.coli），成功地實現了植物來源環氧化物的異源表達，所得的重組酶VrEH1和VrEH2能對映歸一性水解對硝基環氧苯乙烷，生成的(R)-對硝基苯乙二醇的對映體過量值（enantiomeric excess，ee）分別為70.0%和84.8%。又如朱勍團隊[8]從蘋果輪紋病菌中挖掘出一種EH，能夠動力學拆分苯基縮水甘油醚類環氧化物，其中，對rac-oMGE對映體比率（enantiomeric ratio，E）達到48.6。但目前發現的大多數野生EH因為E、ee或活性低等原因，無法滿足工業生產的需求。隨著蛋白質分子改造技術的日益成熟，改造EH 從而改善其性質的研究也屢見報道。如Reetz等[9]通過定點飽和突變技術將一種黑曲霉EH 對rac-oMGE的E值由4.6提高到160。

實驗室前期從菜豆中挖掘出兩種菜豆環氧化物水解酶PvEH1和PvEH2，均能對映選擇性水解racoMGE[9]。現擬通過分子改造提高PvEH2 的催化性能，使其水解rac-oMGE 時既能保留單構型環氧化物，又能生成較純的單構型鄰二醇。先同源模擬PvEH1 和PvEH2 的三維結構，然后替換PvEH2 分子結構中的蓋子環區域，再利用分子對接技術選取距離底物8?（1?=0.1nm）以內的非保守氨基酸，將其全部突變為丙氨酸，得到了一個最優突變子Pv2Pv1K176A，并采用分子對接模擬分析其區域選擇性提高的原因，最后用E. coli/pv2pv1K176A催化高濃度rac-oMGE。

1 實驗材料與方法

1.1 菌株與質粒

E. coli BL（DE3）和E. coli JM109，保存于本實驗室；克隆質粒pUCm-T，上海Sangon公司；表達質粒pCold Ⅱ，美國Novagen公司。

1.2 試劑與儀器

1L LB 培養基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和NaCl 10g（固體培養基另加20g 瓊脂粉），pH 調至7.0。質粒提取試劑盒（無錫康為世紀公司）。rac-oMGE（上海TCI 公司）。全溫搖瓶柜HYG-A（江蘇太倉實驗設備廠）；高速冷凍離心機5804R（德國Eppendorf 公司）；實驗所用酶均購于上海Sangon生物技術有限公司。液相色譜OD-H手性柱（250mm×4.6mm×5μm）購自大賽璐藥物手性技術（上海）有限公司。

1.3 PvEH2的結構分析

在Swiss-Prot Protein 數據庫（http://www.ebi.ac.uk/swissprot/）中搜索與PvEH2 同源性最高且結構和功能已知的蛋白分子，以此蛋白三維結構為模板在SWISS-MODEL 網 站（https://swissmodel.expasy.org/）中模擬出PvEH1和PvEH2的三維結構。利用PyMOL軟件（https://pymol.org/2/）對它們的三維結構進行可視化分析。

表1 FPCR所用引物

1.4 PvEH2的蓋子環替換

本節所用引物如表1所示，由無錫亦欣生物公司合成。提取含有PvEH2 編碼基因的大腸桿菌轉化子質粒（pCold Ⅱ-pveh2），并作為模板，通過三輪融合聚合酶鏈式反應（FPCR）獲得目的基因pv2pv1。第一輪以pveh2-F 和pv1pv2-R 作為引物，在DNA聚合酶PrimerSTAR HS DNA polymerase作用下進行PCR：98℃變性3min，30 個循環（98℃，30s；50℃，30s和72℃，40s），72℃充分延伸10min，對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并割膠回收。再以回收產物為模板，pveh2-R 和pv2pv1-F 為第二輪引物，其他條件不變進行擴增、檢測和割膠。最后以第一輪和第二輪產物作為第三輪PCR 的上下模板，pveh2-F和pveh2-R為引物，其他條件不變，獲得蓋子環被替換的EH 編碼基因pv2pv1。連接pUCm-T 載體，轉化E. coli JM109 并用氨芐西林（Amp）篩選陽性克隆子送至上海Sangon 生物技術有限公司進行DNA 測序驗證，測序成功的轉化子命名為pUCm-T-pv2pv1，用Nde I 和Sal I 雙酶切，最終連接至pCold Ⅱ，轉入E. coli BL21（DE3），經Amp 抗性篩選、驗證并且測序正確的重組菌株命名為E.coli/pv2pv1。

1.5 全細胞酶的誘導及催化特性分析

將獲得的菌接種（接種量為1%）于2mL含0.1μg/L Amp 的LB 培養基中，于37℃、220r/min 條件下培養過夜；取2mL 培養液轉接于100mL 含0.1μg/L Amp 的LB 培養基中，培養至OD600（在600nm 波長處的吸光值）為0.6～0.8時，加入0.1mL 500mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG） 至終濃度為0.5mmol/L，14℃誘導16h后離心收集濕菌體。

稱取0.1g 濕菌體懸浮于1mL 磷酸鈉緩沖液（100mmol/L，pH=7.0）中，取0.3mL 100g/L菌懸液加到含0.65mL磷酸鈉緩沖液的2mL 環氧樹脂（EP）管中，20℃孵育5min 后加入50μL rac-oMGE（200 mmol/L，溶劑為甲醇）至終濃度為10mmol/L，20℃恒溫震蕩反應10min，取150μL 樣品用1mL 乙酸乙酯萃取，有機相經無水硫酸鎂干燥。樣品采用高效液相色譜儀（Waterse2695）、手性液相色譜柱（OD-H）和紫外檢測器（Waters2489）進行分析。高效液相色譜條件為：流動相為正己烷∶異丙醇=80∶20（體積比），柱溫30℃，流速為0.8mL/min，檢測波長為220nm。(R)-oMGE、(S)-oMGE、(R)-oTPD和(S)-oTPD 的保留時間分別為6.69min、8.03min、8.83min和9.82min。

在上述測定條件下，酶活單位（U）定義為每分鐘消耗1μmol 的rac-oMGE 所需的酶量。全細胞比活力（U/g）計算公式如活性=C0×v×c/(t×m)所示。其中c為全細胞催化rac-oMGE的轉化率，%；C0為底物初始濃度，mmol/L；t 為反應時間，min；v 為反應體積，mL；m為濕細胞質量，g。

底物的ees=(RS-SS)/(RS+SS)×100% 和產物eep=(SP-RP)/(SP+RP)×100%。其中RS和SS分別代表(R)-oMGE和(S)-oMGE的峰面積；RP和SP表示(R)-oTPD和(S)-oTPD 的峰面積。酶的對映選擇性用E 來評價，E=ln[(1-c)(1-ees)]/ln[(1-c)(1+ees)]，E值越高，則對映選擇性越高[10]。

區域選擇性系數αS和βR（圖1）可由線性回歸方程eep=(βS-αR)×ees×(1-c)/c+αR+βS-1進行計算[11]。eep和ees×(1-c)/c 定義為因變量和自變量。通過測定酶催化rac-oMGE 水解過程中不同時間點的c、ees和eep，對上述線性方程進行擬合，從而算得αR，βS。

1.6 Pv2Pv1的丙氨酸突變

圖1 區域選擇性的示意圖

將Pv2Pv1 和另外4 種植物來源的EH 的一級結構進行同源序列比對，找出非保守氨基酸（同源性≤60%）。根據1.3節方法對Pv2Pv1同源建模，再通過AutoDock4.2 軟 件（http://autodock.scripps.edu）進行分子對接，用PyMOL 找出距離(R)-oMGE 8?以內的非保守氨基酸，并通過兩輪全質粒PCR 將這些氨基酸突變為丙氨酸（A）。根據相關文獻設計突變引物[10]。一輪PCR所用的上游引物為設計的突變引物，下游引物為通用引物pCold Ⅱ-R，預變性95℃，4min；變性98℃，10s；退火55℃，5s；延伸72℃，1min；從變性到延伸循環30 次，最后充分延伸，72℃，10min。二輪PCR 以一輪PCR 產物為引物，全質粒為模板，除延伸時間變為5min，其他條件同第一輪。產物經限制性內切酶DpnI 消化后導入E. coli BL21（DE3），培養12h 后對轉化子進行菌液PCR驗證，并對陽性轉化子進行測序，將測序結果正確的轉化子命名為E.coli/pv2pv1突變位點。

1.7 分子對接分析

用ChemDraw Ultra 12.0 軟 件 （http://www.cambridgesoft.com/）構建(R)-oMGE的三維結構。參照1.3 節方法模擬Pv2Pv1 和Pv2Pv1K76A的三維結構模 型。采 用AutoDock 4.2 將PvEH2、Pv2Pv1 和Pv2Pv1K76A分別與(R)-oMGE 進行分子對接，通過Gromacs（http://www.gromacs.org/）進行分子動力學模擬，將生成的結合能最低的構象作為最佳構象，用PyMOL分析所得構象。

1.8 E.coli/pv2pv1K76A水解高濃度rac-oMGE

為了確定E.coli/pv2pv1K76A水解動力學拆分racoMGE的最大濃度，在10mL EP管中，用200mg/mL的E.coli/pv2pv1K76A催化不同濃度（80～180mmol/L）的rac-oMGE，反應體系2mL，25℃反應2～8h。測定ees、eep、YP和YS。在確定最大反應濃度后，放大反應體系至10mL，在25℃條件下用200mg/mL的E.coli/pv2pv1K76A水解150mmol/L 的rac-oMGE，定時進行取樣監測，參照方法1.5用HPLC測定殘余的(R)-oMGE、(S)-oMGE 及生成的(R)-oTPD、(S)-oTPD 的濃度，并計算ees、eep、YP和YS，繪制反應進程曲線，同時計算時空產率[space-time yield, STY，表示在一定的反應條件下，單位體積單位時間獲得目的產物總量，g/(L·h)[11]]。

2 實驗結果與討論

2.1 PvEH2和PvEH1的三維結構分析

實驗室前期挖掘了兩種菜豆環氧化物水解酶，PvEH1 和PvEH2，它們均能對映選擇性水解racoMGE，優先水解S構型，保留R構型。當S構型的底物水解完全時（ees＞99%），所生成的(S)-oTPD的eep僅有8.3%和53.6%，其中全細胞酶E. coli/pveh1 對rac-oMGE 的活性為157.2U/g，遠遠高于E.coli/pveh2的4.1U/g[12-13]。

以PvEH2一級結構為模板，在SWISS-MODEL網站找到一個同源性最高（80.06%）且功能已知的綠豆環氧化物水解酶（VrEH1，PDB∶5XMD.2），并以它為模板模擬PvEH2、PvEH1的三維結構。結果顯示，PvEH2 和PvEH1 均屬于α/β 水解酶家族，催化三聯體為Asp-His-Asp 和兩個Tyr 質子供體分別位于中心結構域和蓋子結構域（圖2）。其中蓋子環是蓋子結構域中的一段可變環，在不同的EH中，它的結構差異很大，因而對EH的催化性質影響很大[14]。PvEH2和PvEH1的蓋子環在結構上有很大的差異，如圖2(b)。基于全細胞酶E.coli/pveh1的高酶活，期望通過蓋子環替換改善E.coli/pveh2 的酶活及其他催化性質。

圖2 PvEH1和PvEH2的三維模擬結構比對

表2 E.coli/pveh2及/pveh2cl1的相關催化性質

2.2 Pv2Pv1的催化性質分析

按1.4 節方法獲得了重組菌E. coli/pv2pv1，誘導表達收菌后，按1.5 節方法對其相關催化性質進行分析，其活性幾乎沒有發生變化，E值由23.0下降到15.1，當底物的ees＞99%時，其產物(S)-oTPD的eep由E. coli/pveh2 的58.3%提高到75.5%，通過對區域選擇性系數的分析發現，出現該現象的原因是αR由3.8%提升至42.4%。保留的(R)-oMGE 的產率（Ys） 有所降低，但是產物(S)-oTPD 的產率（Yp）由42.9%提高至58.4%（表2）。表明蓋子環替換后的Pv2Pv1，有一定的能力使(R)-oMGE 翻轉生成(S)-oTPD。

2.3 丙氨酸突變位點的選擇

運 用AutoDock 4.2 對Pv2Pv1 和(R)-oMGE 進 行分子對接，其結果如圖3(a)所示。距離底物8? 以內的氨基酸殘基共計有32個[圖3(c)中“*”表示]。與其他4 種植物來源的EH 序列比對，除去包括催化三聯體和兩個質子供體在內的17個保守位點和4個相對保守位點，一共有11 個非保守氨基酸位點：

I105、W129、P137、K175、L176A、N179、L187、P203、I238、S266 和M273[圖3(b)]。據報道，突變EH中的非保守氨基酸，能很好地改善其催化性質，如Li等[14]通過突變PvEH3中的非保守氨基酸，將產物對氯苯基乙二醇的eep由85.1%提高至93.2%，Kong等[15]通過在BmEH的催化活性中心附近進行丙氨酸突變，大大地提高了其對α-萘基縮水甘油醚的活性和對映選擇性。因此，本研究選擇將以上11個非保守氨基酸突變為丙氨酸。

2.4 丙氨酸突變子的催化特性分析

按1.6節方法獲得11個丙氨酸突變子，用全細胞催化反應，按1.5 節方法測定各突變子對racoMGE 的催化特性。如表3 所示，11 個突變子中，E.coli/pv2pv1K176A的催化性能綜合表現最為優越，與E.coli/pv2pv1 相比，催化性能得到明顯提升，活性由4.2U/g提高至8.7U/g，提高了2.1倍。當S構型的底物剛好反應完全時，R 構型的鄰二醇的eep由75.5% 提高至80.3%，產率也由58.4% 提高至61.9%。經測定，區域選擇性系數βS=4.6%，αR=52.2%，αR相對于Pv2Pv1提高了9.8%。

表3 丙氨酸突變子對rac-oMGE的催化特性分析

2.5 分子對接分析區域選擇性提高原理

為了從分子水平了解Pv2Pv1及Pv2Pv1K176A區域選擇性系數αR提高的原理，運用AutoDock 4.2 將PvEH2、Pv2Pv1、Pv2Pv1K176A與(R)-oMGE 進 行 對接，對接后的局部放大圖如圖4。根據Reetz等[16-17]關于EH催化機理的研究：位于活性中心的天冬氨酸的O原子通過攻擊環氧環上的C原子，從而使環氧環斷開，其中，天冬氨酸中的氧到環氧環中Cα原子的空間距離dα是一個關鍵參數，dα越短，Cα越容易受到O 原子的攻擊，其αR值越大。PvEH2 的dα=4.5?，經過蓋子環的替換后，dα變為3.1?，在上述的實驗檢測中，其對應的αR值由3.8%提高到42.4%，丙氨酸突變后dα進一步縮短為2.9?，αR進一步變為52.2%。對接分析結果和實驗測量結果相符。

2.6 E.coli/pv2pv1K176A水解高濃度rac-oMGE

為確定E.coli/pv2pv1K176A能水解rac-oMGE 的最大濃度，使用200mg/mL菌懸液分別拆分80mmol/L、100mmol/L、120mmol/L、150mmol/L 和180mmol/L的rac-oMGE。當E. coli/pv2pv1K176A水解150mmol/L的rac-oMGE時，5.0h水解完全，得到(R)-oMGE和(S)-oTPD 的產率YS和YP分別為32.5%和59.1%，相應對應體純度ees＞99%，eep=80.9%。由于EH 存在底物或產物抑制的現象[4]，當rac-oMGE 的濃度達到180mmol/L 時，即使反應時間延長至8.0h，ees仍然僅為70.3%。因此，確定E. coli/pv2pv1K176A水解rac-oMGE的最大底物濃度為150mmol/L。

圖3 Pv2Pv1與4種植物EH一級結構的多序列比對

圖4 PvEH2、Pv2Pv1和Pv2Pv1K176AL與（R）-oMGE的分子對接模擬（1?=0.1nm）

用200mg/mL E. coli/pv2pv1K176A在10mL 體系中水解150mmol/L rac-oMGE。其水解反應進程圖5所示。在反應5.0h 后，(S)-oMGE 完全水解完（ees＞99%），得到(R)-oMGE的產率為32.5%，高于AnEH的29%，但低于TlEH 的40%，得到(R)-oMGE 的產率為32.7%，高于AnEH的29%，但低于TlEH的40%，STY為1.6g/(L·h)，分別是AnEH和TlEH的6.7和2.4倍。(S)-oTPD 的產率為60.1%，eep為80.4%，均高于TlEH，STY為3.3g/(L·h)，是TlEH的3.5倍[18-19]。

圖5 200mg/mL E.coli/pv2pv1K176A水解150mmol/L rac-oMGE的進程圖

3 結論

（1）本研究通過FPCR，構建了一種蓋子環替換的雜合酶Pv2Pv1，通過分析其催化性質，Pv2Pv1在水解rac-oMGE時，當S構型的底物水解完全時，得到的產物(S)-oTPD的產率和eep都有明顯升高。

（2）獲得11 個丙氨酸突變子，其中，E. coli/pv2pv1K176的酶活，(S)-oTPD的產率，eep都有進一步的提升。通過分子對接分析發現相對于PvEH2 和Pv2Pv1，Pv2Pv1K176有著最短的dα，從而解釋了其區域選擇性系數αR提高的原因。

（3）用E.coli/pv2pv1K176水解高濃度rac-oMGE，發現其具有應用于工業化生產的潛能，同時該酶也存在一定的缺陷，如酶活和產物(S)-oTPD 的eep還有進一步的提升空間，今后可以通過定向進化的手段對其催化性能進行進一步的優化和改造。