三唑酮分子印跡納米球的制備及應用

李子怡，李志君，顧麗莉，師君麗，陳昱安，韓毅，佟振浩，孔光輝

（1 昆明理工大學化學工程學院，云南昆明650500；2 云南省煙草農業科學研究院，云南玉溪653100）

三唑類殺菌劑是一類含有1,2,4-三唑環的化合物，由于其低毒、內吸性強、持效期長等優點，廣泛應用于果蔬和稻谷等病蟲害的防治[1]。楊益軍[2]統計了2015 年全球銷售額前15 位的殺菌劑，三唑類有5種，占1/3。但隨著三唑類農藥的大量應用，其在農產品和環境中的殘留問題也逐漸引起人們的關注。目前，三唑類殺菌劑殘留量的測定方法[3-12]主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣質聯用、液質聯用、毛細管電泳法和生物免疫檢測法等，這些檢測方法均要求配備高效的樣品前處理過程。

近年來，基于分子印跡技術的三唑類殺菌劑殘留分析已有報道。佘永新等[13]研發了一種三唑類分子印跡聚合物微球固相萃取柱，微球粒徑為2μm左右，該報道沒有明確聚合物粒徑與其吸附性能的關系；胡艷云等[1]建立了三唑酮分子印跡固相萃取-液相色譜-質譜法測定果蔬中多種三唑類農藥的檢測，但其特異性吸附效果不顯著，最大印跡因子為1.45。針對三唑類分子印跡聚合物顆粒粒度較大（1～2μm 及以上）、粒徑分布寬、團聚現象明顯、印跡效果不顯著等問題，本文制備了一種粒度高度均勻、特異吸附性能良好的分子印跡納米球，該納米球對模板分子及其結構類似物具有良好的選擇性吸附能力和較高的印跡效應。由此分子印跡納米球組裝的固相萃取柱用于煙草樣品的前處理，對煙草樣品中三唑類殺菌劑的檢測效果良好，為復雜基質中該類農殘的檢測提供了有效手段。

1 實驗材料和方法

1.1 儀器與材料

掃描電子顯微鏡（SEM），Tecnai G2 TF30 STwin 型，荷蘭FEI 公司；馬爾文粒度分析儀，Zetasizer Nano ZS90 型，美國Malvern Inc；傅里葉紅 外 光 譜 儀（FTIR）， Equinox55 型， 德 國BRUKER 公司；臺式高速離心機，TG16-WS 型，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；旋轉蒸發儀，RE-2000A 型，上海亞榮生化儀器廠；氣浴恒溫振蕩器，ZD-85 型，金壇市城東新瑞儀器廠；超高效液相色譜儀，Agilent 1290 Infinity UHPLC 型，美國Agilent Technologies；質譜儀，AB Sciex Qtrap (TM) 3200 MS/MS 型，美國AB Sciex，CA。

三唑酮（triadimefon，TDF），標準品純度為99%，AccuStandard；三環唑（tricyclazole，TCZ），標準品純度為99%，阿拉丁上海試劑有限公司；腈菌唑（myclobutanil，MT），標準品純度為98.5%，阿拉丁上海試劑有限公司；亞胺唑（imibenconazole，IBZ）、烯唑醇（diniconazole，DNZ）、戊 唑 醇（tebuconazole，TEB）、己 唑 醇（hexaconazole，HXZ）、氯 磺 隆（chlorsulfuron，CS）和莠去津（atrazine,ATZ），標準品純度為97%、99.2%、99.3%、98%、99%和99%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司；丙環唑（propiconazole，PPZ），純度為91.3%，CATO Research Chemicals Inc.；氟硅唑（flusilazole，FSZ），標準品純度為98%，天津希恩思生化科技有限公司；偶氮二異丁腈[2,2′-azobis(2-methylpropionitrile)，AIBN]和乙二醇二甲基丙 烯 酸 酯 （ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA），分析純，北京百靈威科技有限公司。

1.2 三唑類分子印跡預組裝體系的計算機模擬

本文采用密度泛函理論（density functional theory，DFT）[14-16]，通過Gaussian09 模擬計算了5種功能單體分別與TDF 的復合物構型、結合能及其強度分布，推測出不同功能單體與TDF 的聚合比例；計算了最佳復合物在5種溶劑中的溶劑化能與偶極矩；進而估算了最佳復合物在最優溶劑中自組裝過程的熱力學性質和紅外光譜圖。

1.3 三唑酮分子印跡納米球制備條件

100mL硼硅酸玻璃瓶中依次加入0.2mmol TDF、0.8mmol MAA 和50mL 乙腈，混合均勻，30℃下超聲通N210min 后置于30℃恒溫氣浴振蕩器中預聚12h，然后加入30mg AIBN和4mmol EGDMA，混合均勻，通N210min后置于30℃恒溫水浴震蕩器，隨后將溫度緩慢升至60℃，聚合24h。聚合結束后，將聚合物靜置至室溫，在10000r/min 下離心分離，倒掉上清液，將干燥后的聚合物放入索氏提取器，用甲醇∶乙酸=9∶1 重復洗脫聚合物中的模板分子，至超高效液相色譜（UHPLC）檢測上清液中無TDF 為止。繼而用甲醇洗滌聚合物呈中性后，將聚合物置于50℃下真空干燥至恒重，得到三唑酮分子印跡聚合物（TDF-MIPs）。作為對照，非分子印跡聚合物（NIPs）的制備除了不加入模板分子外，所有步驟與MIPs的制備一致[17-20]。

1.4 靜態吸附實驗

準確稱取20mg 的MIPs 和NIPs 各12 份于10mL離心管中，分別加入不同濃度（0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、0.8mg/L、1mg/L、2mg/L、5mg/L、8mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L 和25mg/L）的TDF-乙腈溶液5mL。將離心管在25℃下恒溫振蕩8h，然后在8000r/min 下離心10min，取3mL 上清液用0.22μm濾膜過濾后用UHPLC 檢測TDF 的濃度。該過程平行實驗3次，檢測結果取平均值[21-22]。

1.5 選擇性吸附實驗

準確稱取20mg MIPs 和NIPs 各11份于10mL 離心管中，分別加入5mL 濃度為20mg/L 的不同種類農殘標準品的乙腈溶液。將離心管在25℃下恒溫振蕩8h 后，在8000r/min 下離心10min，取3mL 上清液過0.22μm 濾膜后用UHPLC 檢測各種農殘的濃度。該過程平行實驗3次，檢測結果取平均值。

1.6 分子印跡固相萃取柱的裝填

準確稱取若干份100mg 的MIPs 及NIPs，分別裝填于3mL 的固相萃取空柱中，填料上下兩端放置0.45μm 濾 膜， 制 得MISPE 柱（molecularly imprinted solid phase extraction，MISPE）和NISPE柱（noimprinted solid phase extraction，NISPE）。

表1 9種三唑類殺菌劑的標準曲線、線性范圍、相關系數、檢測限及定量限

1.7 標準曲線與檢出限和定量限

分別稱取9 種三唑類殺菌劑10mg 溶于乙腈溶液，配制為100mg/L混標溶液，然后稀釋為不同濃度（0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2 mg/L、0.5mg/L、1mg/L和2mg/L），采用UHPLC-MS/MS分析檢測。色譜柱條件為：Waters BEH-C18（2.1mm×150mm，1.7μm）；流速，0.3 mL/min；檢測波長，228nm；進樣量，1μL；柱溫，30℃；洗脫方式，梯度洗脫，流動相A、B分別為0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液。質譜儀條件為：電噴霧離子源；離子噴射電壓，5500V；霧化溫度，550℃；掃描方式，正離子掃描；檢測方法，多反應檢測模式。以殺菌劑的濃度為橫坐標X，響應峰面積為縱坐標Y，在不加權的情況下對檢測結果進行回歸運算，得到9種農藥的標準曲線，如表1所示。數據表明，9種殺菌劑在一定范圍內線性關系良好（r≥0.9995），檢測限為4.82～11.97ng/mL（S/N≥3），定量限為16.07～39.90ng/mL（S/N≥10）。

1.8 煙葉樣品及煙葉上樣液的制備

將煙葉破碎后過40 目篩，在50℃恒溫真空干燥至恒重。稱取若干份1g 干燥煙葉樣品，分別置于10mL 離心管中，添加不同濃度的9 種農殘混合標準溶液1mL，加標濃度分別為0.01μg/g、0.05μg/g、0.1μg/g、0.5μg/g，然后渦旋振蕩5min 使其充分混勻，室溫靜置24h 后放入50℃真空干燥箱干燥2h，即得到加標煙葉樣品。

向加標煙葉樣品中加入10mL 乙腈，30℃下超聲萃取30min后離心收集上清液，過0.22μm濾膜，將濾液轉移到50mL 旋轉蒸發瓶中，待旋蒸。濾渣與離心管底部的煙葉萃余物合并，再加入5mL 乙腈進行第二次萃取（萃取條件同第一次）。合并兩次萃取濾液，旋轉蒸發后，用1mL 乙腈復溶，得煙葉上樣液。

2 實驗結果與討論

2.1 三唑類分子印跡預組裝體系的計算機模擬

2.1.1 模板分子與功能單體的構型優化

模板分子TDF 與5 種單體（TFMAA、AA、AM、MAA 和4-VP）的幾何構型及靜電勢分布如圖1所示。TDF有3個失電子和1個弱受電子位置，AA、AM和MAA均各有1個失電子和1個受電子位置，TFMAA 有一個受電子位置，4-VP 有1 個失電子位置，根據電正性和電負性越強的地方形成非共價鍵的活性越高原理[15]，可初步判斷模板分子與功能單體的最大結合比例。

圖1 TDF與單體TFMAA、AA、AM、MAA和4-VP的靜電勢分布圖

2.1.2 復合物的結構及配比優化

TDF 與5 種功能單體的相互作用能（ΔE）、鍵長與鍵角列于表2。從表2中可見，AM與TDF的相互作用能較低，而且小于自身締合作用，為不可選功能單體。4-VP 與TDF 的鍵長已超出典型氫鍵鍵長1.627～2.169?（1?=0.1nm）[23-24]范圍，無法與TDF 形成預聚合物。MAA 與TFMAA 在AA 結構上增加甲基或三氟甲基，可增加AA結構穩定性，增強羥基H 的受電子能力；TFMAA 的三氟甲基具有電負性，消減了羥基H 給電子能力，MAA 中的羥基H給電子能力更強。TDF的3個失電子元素分別與三分子MAA 的受電子元素形成3 個氫鍵，而TDF上的1個弱受電子元素與MAA的1個失電子元素不能形成氫鍵，且TDF-MAA 復合物的|ΔE|高于TDF-TFMAA 復合物的|ΔE|。表3 是TDF 與MAA 和TFMAA 在各結合點位的作用能。由表3 和圖1 可見，TDF 在O3、N5 和N6三個個結合位點可以接受質子，原子電荷數分別為-0.311、-0.312和-0.311，均可與TFMAA和MAA形成氫鍵結構。TDF在N5與MAA 的相互作用結合能較大，在N6 和O3 的結合能相近，且3個結合位點的結合能相近；而TDF與TFMAA 在N6 的結合能與在N5和O3的結合能差異較大。因此，TDF-MAA 比TDF-TFMAA 的復合結構更為穩定[25-26]。后續MIPs 的制備中采用MAA 為功能單體，并考慮TDF 與MAA 之間存在的氫鍵之外的弱作用力影響，選擇TDF 與MAA 的聚合比例為1∶4。圖2為TDF與4種功能單體的預聚合構型優化及配比情況[27]。

表2 TDF與5種單體相互作用能ΔE、鍵長與鍵角

表3 TDF與MAA和TFMAA各結合點位的作用能

實驗中，通過檢測不同配比下[(1∶1)～(1∶4)]預聚合物的紫外光譜。在1∶4 時，吸光度最小，說明TDF 與MAA 自組裝過程最強，進而印證了TDF與MAA配比為1∶4時自組裝效果最佳[28-29]。

2.1.3 溶劑的選擇

圖2 TDF分別與4種功能單體形成復合物的幾何結構

溶劑對TDF-MAA 復合物的溶劑化會促進氫鍵斷裂和降低反應活性。將實驗與模擬結合可快速選擇最佳溶劑，制備方法為沉淀聚合法。分別選擇了微孔型甲苯、氯仿、大孔型二氯甲烷、乙腈和水5種溶劑對印跡體系的溶劑化效應進行模擬研究[30]。如表4所示，ΔE溶劑越大說明溶劑對TDF-MAA復合物結構影響越大，越不利于形成氫鍵，不利于自組裝過程的進行，按照溶劑化能從小到大的順序排序：甲苯＜氯仿＜二氯甲烷＜乙腈＜水，取前4種有機溶劑進行實驗比較。

表4 TDF-MAA在5種溶劑中的溶劑化能和偶極矩

在相同條件下，制備4 種溶劑的MIPs，結果表明：以甲苯和二氯甲苯為溶劑所制備的MIPs 產量少，團聚明顯，球形度差，粒徑誤差大。氯仿-MIPs 微球粒徑為1000nm 左右，乙腈-MIPs 微球粒徑在200～300nm 之間，乙腈-MIPs 微球的比表面積遠高于氯仿-MIPs 微球，進一步用20mg/L TDF溶劑作為吸附質進行吸附實驗，結果表明：乙腈-MIPs 最 大 吸 附 量 是955.3μg/g，而 氯 仿-MIPs 是250μg/g，相差3.8倍。大孔溶劑形成的大孔結構更利于物質擴散，適當提高大孔數量將有利于MIPs對模板分子及其類似物的識別能力。故而，乙腈是沉淀聚合法制備TDF-MIPs的適宜溶劑。

2.1.4 復合物的紅外光譜分析

圖3(a)為復合物在真空介質和乙腈溶劑中模擬的紅外光譜圖，圖3(b)為乙腈-MIPs 紅外光譜圖。比較乙腈-復合物的模擬光譜線和乙腈-MIPs 實體的光譜線，兩者的主要吸收峰位置相似，說明計算機模擬的紅外光譜具有相對準確性。與真空介質對比，兩者的吸收光譜均發生紅移現象，表明預聚合反應中模板與單體氫鍵結合的激發態能量傳遞給乙腈分子，基團在乙腈中振動所需的能量降低，直接影響結構的穩定性。由此可見有必要考察適宜的溶劑用量，有益于形成穩定的聚合物結構。

圖3 模擬TDF-MAA復合結構和乙腈-TDF-MIPs紅外光譜圖

在相同條件下，改變乙腈用量（30mL、40mL、50mL、60mL、70mL 和80mL）制備了6 種不同的TDF-MIPs 和NIPs。通 過UHPLC 檢 測6 種TDFMIPs 和NIPs 的飽和吸附量（20mg/L TDF-乙腈溶劑），計算其印跡因子，如表5 所示，結果表明：隨著溶劑量的增加，TDF-MIPs 微球飽和吸附量先增加后減少，與印跡因子的變化規律一致，其中，溶劑量50mL的MIPs微球分布分布最窄，平均粒徑較小，其吸附性和結構性更穩定。

表5 不同溶劑用量下MIPs的飽和吸附量、印跡因子與粒度特征

2.1.5 復合物自組裝過程的熱力學分析

在特定溫度下，根據正則系綜理想氣體估算分子熱力學數據（H、G和S）[15]。模擬中選擇不同溫度（0～30℃）和不同介質（真空與乙腈）下，對復合物自組裝過程：TDF+3MAATDF-MAA 進行熱力學分析，表6 是復合物自組裝過程的焓變（ΔH）、熵變（ΔS）和吉布斯自由能變化（ΔG）。

由表6可見，復合物形成過程中，ΔH和ΔG均大于零，ΔS 為負值，隨著溫度的升高，三者均有小幅度增加，表明TDF-MAA預聚合反應是非自發吸熱反應，但溫度對反應影響不大，實驗中選擇30℃進行預聚合反應。

2.2 三唑酮分子印跡聚合物納米球性能表征

表征最優條件（1.3 節）下的TDF-MIPs 的形貌、粒徑等基本性能。

圖4(a)中TDF-MIPs 粒徑在200nm 左右，無粘連和團聚現象，非平滑均勻準球表明存在大量多層次褶皺，預示該聚合物有較大的比表面積，有利于目標化合物的吸附和脫附。從TDF-MIPs 粒度分布圖4(b)顯而易見，聚合物粒徑均勻，主要集中在190～220nm，與場發射掃描電鏡結果一致。

圖4 TDF-MIPs的形貌和粒徑圖

圖5 TDF、TDF-MIPs與NIPs的紅外光譜圖

TDF、TDF-MIPs 洗脫前、TDF-MIPs 洗脫后及NIPs 的紅外光譜見圖5。TDF-MIPs 洗脫前光譜圖中出現4 處明顯特征峰，波數673.7cm-1處是C Cl伸縮振動峰；1586.4cm-1處是芳環中C C伸縮振動峰，即TDF中苯環的骨架振動；1665cm-1處是羰基C O伸縮振動峰，因在NIPs和TDF-MIPs洗脫后未出峰，可以排除是甲基丙烯酸中的羰基，則此處為TDF中的羰基；3130cm-1處為苯環上不飽和的C H伸縮振動峰，TDF 在以上4 處均有對應峰值出現。由此證明，聚合物中存在TDF 分子；對比圖TDFMIPs洗脫后，不存在這4處特征峰，說明聚合物中的TDF分子被完全洗脫。此外，分析以上4個紅外光譜圖所共有的較強特征峰發現，1158cm-1處可能為交聯劑EGDMA 中O C O 的伸縮振動峰；1257cm-1處可能為功能單體MAA 羧基中C O 的伸縮振動峰；1730cm-1處為EGDMA 和MAA 中C O的伸縮振動峰。綜上，可以證明EGDMA 和MAA的存在，并且模板分子與功能單體、交聯劑發生了共聚反應。

表6 在不同條件下復合物形成過程的熱力學相關數據

2.3 靜態吸附實驗

圖6(a)是TDF-MIPs及NIPs在不同TDF-乙腈溶液中的吸附量。從圖6(a)中可以看出，MIPs的結合量隨著TDF 濃度的增加而增加，因具有高親和吸附位點（特異性吸附）和低親和吸附位點（表面吸附特性），相比只有表面吸附特性的NIPs有更高的吸附容量。圖6(b)為Scatchard分析后線性擬合結果圖，分別擬合得到MIPs高親和直線與低親和直線，兩者斜率不同，說明TDF-MIPs 存在兩類吸附位點。根據Scatchard分析，計算得到高親和位點的解離常數為15.237μg/mL和最大表觀結合量是1502.582 μg/g。低親和位點的解離常數為2.039μg/mL和最大表觀結合量是522.99μg/g。

2.4 選擇性吸附實驗

圖6 靜態吸附實驗數據圖

圖7 TDF-MIPs和NIPs的選擇性吸附及印跡因子

為了考察所制備的TDF-MIPs選擇性識別能力，選用9 種常見三唑類殺菌劑、1 種磺酰脲類和1 種三嗪類除草劑為目標物，檢測TDF-MIPs對以上11種農藥的吸附量。結果如圖7所示。

圖7 表明，除氟硅唑外，TDF-MIPs 對上述8種三唑類殺菌劑具有良好的吸附性，最大印跡因子可達到2.42，相較于NIPs，MIPs 的吸附量和特異吸附性均較高。TDF-MIPs 的孔穴在空間結構和結合點位上與TDF 分子切合，能夠有效地嵌入TDF實現特異性吸附和分離，而分子結構的類似性使TDF-MIPs 對三唑類化合物具有普遍的特異吸附性。相對而言，NIPs 僅能對各種農殘分子進行表面吸附。對于氟硅唑，其分子量大、空間結構與TDF 分子的結構差異較大，TDF-MIPs 的主要作用為表面吸附，其MIPs 與NIPs 的吸附量基本一致，更小粒徑的NIPs 反而有更高的表面吸附量。TDFMIPs 對非類似結構的氯磺隆和莠去津基本無特異性吸附。

2.5 三唑酮分子印跡聚合物納米球的應用

取空白煙葉樣品，按照1.7 節和1.8 節進行制樣、樣品前處理和檢測，計算回收率和標準偏差，結果列于表7。由表7 可見，除氟硅唑外，其他8種三唑類殺菌劑在加標濃度為0.01～0.5μg/g 范圍內的平均回收率為70.14%～105.43%，多次測量的標準偏差為0.26%～2.27%。同一濃度水平下，三唑酮和腈菌唑的平均回收率達95%以上，戊唑醇、己唑醇和烯唑醇高于85%，丙環唑、三環唑和亞胺唑大于70%，氟硅唑僅為50%～60%，TDF-MIPs的吸附性能與2.4節的選擇性吸附結論一致。

3 結論

本文以沉淀聚合法制備了粒度高度均勻、特異性吸附性能良好的TDF-MIPs 納米微球，并以TDF-MIPs 為吸附劑，對煙葉樣品進行固相萃取前處理，建立了TDF-MISPE-UPLC-MS/MS 方法對煙葉中8種三唑類殺菌劑的殘留進行同時檢測。研究主要分為計算機模擬與實驗兩部分。

表7 加標回收率和精密度（n=6）

（1）運用Gaussian09軟件針對TDF篩選最優功能單體MAA，分析了TDF 與MAA 潛在的結合位點并得到最大配比數；模擬了常用的5種不同極性與致孔特性的溶劑對TDF-MAA溶劑化效應，并通過實驗確定乙腈為沉淀聚合溶劑；估算了TDF-MAA在真空和乙腈中的預聚合過程與紅外光譜圖，從熱力學角度分析得到TDF+MAATDF-MAA 為吸熱非自發過程，確定預聚合溫度為30℃。

（2）通過改變溶劑和用量得到了聚合物最佳配比TDF∶MAA∶EGDMA=1∶4∶20，乙腈50mL，AIBN 0.03g；所得TDF-MIPs 納米顆粒均勻，平均粒徑為200nm，最佳飽和吸附量可達955.3μg/g，對模板分子的分離印跡因子達到2.42，對其他常用三唑類殺菌劑也具有良好的特異性吸附能力。

（3）以TDF-MIPs 為吸附劑，對煙葉樣品經固相萃取柱進行前處理，并用UPLC-MS/MS 分析前處理液，煙葉中8種三唑類殺菌劑的固相萃取回收率為70.14%～105.43%，檢出限為4.82～11.97ng/mL，相對標準偏差為0.26%～2.27%（n=6），由此建立了TDF分子印跡固相萃取-超高效液相質譜聯用方法，并對煙葉中8種三唑類殺菌劑（三唑酮、腈菌唑、戊唑醇、己唑醇、烯唑醇、丙環唑、三環唑及亞胺唑）的殘留進行檢測，達到了復雜基質煙葉中多種痕量三唑類殺菌劑同時檢測的要求。