陳醋多酚提取物抗氧化活性及抗疲勞作用研究

商全樂，白迎秋，彭一騰

(北京交通大學(xué) 海濱學(xué)院，河北 滄州 061199)

陳醋是中國四大名醋之一，是由高粱、小麥等為原料經(jīng)糖化、發(fā)酵、氧化、貯陳等一系列工藝釀造而成的[1,2]。陳醋因味道醇厚和營養(yǎng)豐富受到人們的廣泛喜愛，也被列為國家非物質(zhì)文化遺產(chǎn)，具有非常重要的地位。陳醋中除了含有維生素、氨基酸外，還含有豐富的多酚類物質(zhì)，具有抗氧化、抗菌、降血壓、美容養(yǎng)顏等諸多保健功效[3,4]。

陳醋的抗氧化性可能主要源于酚類物質(zhì)，抗氧化活性的強(qiáng)弱也與酚類物質(zhì)的含量相關(guān)，因?yàn)榉宇愇镔|(zhì)可以通過提供化學(xué)性質(zhì)活潑的氫質(zhì)子與過氧化物結(jié)合，從而有助于清除自由基[5]。目前國內(nèi)外對陳醋的功效研究多集中于抗菌、抗氧化等方面，而對其抗疲勞的效果鮮有報(bào)道，這限制了陳醋的進(jìn)一步開發(fā)利用。故本研究利用超聲輔助提取陳醋的多酚物質(zhì)，采用多種指標(biāo)評價(jià)提取物的抗氧化活性，并通過動物實(shí)驗(yàn)初步評價(jià)其抗疲勞功效，有助于更全面地認(rèn)識陳醋的功效，也為陳醋的高值化利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1年陳釀醋：購于山西紫林醋業(yè)公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、抗壞血酸等試劑：美國 Sigma公司；羥自由基(·OH)試劑盒：南京森貝伽生物科技有限公司；血尿素氮(SUN)測試盒、肌糖原及肝糖原檢測試劑盒：上海通蔚生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-5203型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海青浦滬西儀器廠；UV-1700紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司；電熱恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級雄性昆明種小鼠(4月齡左右)120只，體重(20±2) g，由北京交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.4 陳醋多酚提取物的制備[5]

將適量陳醋置于1000 mL旋蒸瓶中，在40 ℃真空濃縮30 min左右，直至旋蒸瓶中陳醋變得粘稠。將旋蒸瓶置于超聲機(jī)中，在40 ℃下用50%乙醇作為溶劑，粘稠陳醋與溶劑體積比為1∶3，提取20 min，即得陳醋多酚提取物。

1.5 總酚含量測定

參考文獻(xiàn)[6]，將沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Folin-Ciocalteu法對提取物和原料中的多酚進(jìn)行檢測和計(jì)算。

1.6 抗氧化活性測定

1.6.1 DPPH 自由基清除活性的測定[7]

配制1 mmol/L的DPPH·乙醇溶液，取2 mL置于離心管中。將陳醋多酚提取物稀釋至50，100，150，200，250 μL/mL，分別取2 mL于離心管中與2 mL DPPH·乙醇溶液漩渦混勻，室溫下靜置避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測定混合溶液的吸光度值A(chǔ)x。同時(shí)，無水乙醇在該波長處的吸光度值為空白，記為A0。陳醋多酚提取物本身在517 nm處的吸光度值為Ax0。以50，100，150，200，250 μg/mL的抗壞血酸作為對比。

DPPH(%)=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%。

式中：A0為無水乙醇的吸光度值；Ax為混合溶液的吸光度值；Ax0為陳醋多酚提取物的吸光度值。

1.6.2 清除·OH 活性測定

具體步驟按照羥自由基(·OH)試劑盒說明書操作，仍以抗壞血酸作為對比。

1.7 抗疲勞活性測定

1.7.1 實(shí)驗(yàn)動物分組

先將120只小鼠在SPF動物房預(yù)飼養(yǎng)7 d，均符合實(shí)驗(yàn)要求，隨后隨機(jī)分為4組，分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組，Ⅰ組為陰性對照，即用蒸餾水灌胃；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組為實(shí)驗(yàn)組，分別用濃度為2，4，8 g/kg的陳醋多酚提取物(溶劑為蒸餾水)灌胃。灌胃計(jì)量為0.1 mL/10 g體重，每天定時(shí)灌胃1次，總灌胃時(shí)間為30 d。

1.7.2 體質(zhì)量測定

正式灌胃飼養(yǎng)前和最后一次灌胃后，分別稱量各組所有小鼠的體質(zhì)量。

1.7.3 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

第30天最后一次灌胃的1 h后，分別從Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組隨機(jī)取10只小鼠，稱量體重后用橡皮泥制作體重5%的負(fù)重物，放在小鼠尾尖向上1 cm處，用保鮮膜包裹好負(fù)重物。快速地將小鼠置于水深30 cm、溫度25 ℃的水箱中，準(zhǔn)確記錄小鼠從開始游泳到沉至底部且10 s無法浮上水面的時(shí)間，該時(shí)間為小鼠負(fù)重游泳時(shí)間[8]。

1.7.4 SUN、肝糖原、肌糖原的測定

第30天最后一次灌胃的1 h后，再分別從Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組隨機(jī)取10只小鼠，快速地將小鼠置于水深30 cm、溫度25 ℃的水箱中，讓其游泳90 min，時(shí)間到后馬上取出小鼠并摘眼球取血。SUN指標(biāo)的測定按照試劑盒說明書操作。處死小鼠，解剖，分別取肝臟和大腿處較為健壯的肌肉，肝糖原、肌糖原指標(biāo)的測定也按照試劑盒說明書操作[8,9]。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均在SPSS軟件中進(jìn)行方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 陳醋多酚提取率

經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定1.4所述方法為提取陳醋中多酚的最佳工藝，利用該方法，多酚提取率高達(dá)95.72%，陳醋多酚提取物中多酚含量為 3.78 mg/mL，說明陳醋中多酚含量較高。較高的提取率以及多酚含量是進(jìn)一步開發(fā)利用陳醋多酚提取物的基礎(chǔ)。

2.2 抗氧化活性

2.2.1 DPPH 自由基清除活性

DPPH 自由基是廣泛存在的一種自由基，性質(zhì)比較穩(wěn)定，當(dāng)以乙醇為溶劑時(shí)，DPPH 自由基在其中呈深紫色。當(dāng)加入自由基清除劑時(shí)，溶液顏色會減輕，自由基清除劑的活性越強(qiáng)，褪色程度越大[10]。由圖1可知，陳醋多酚提取物和抗壞血酸具有良好的DPPH 自由基清除活性，且濃度越高清除率越高，呈線性變化。眾所周知，抗壞血酸是一種自由基清除劑，能有效清除DPPH 自由基，將其與陳醋多酚提取物作對比，發(fā)現(xiàn)陳醋多酚提取物的DPPH自由基清除活性略高。DPPH·清除率與陳醋多酚提取物濃度的線性關(guān)系為：y=0.374x+1.7；DPPH·清除率與抗壞血酸濃度的線性關(guān)系為：y=0.352x-1.8。

圖1 陳醋多酚提取物和抗壞血酸的DPPH·清除活性Fig.1 DPPH· scavenging activity of mature vinegar polyphenol extract and ascorbic acid

2.2.2 ·OH清除活性

·OH也是一種常見的自由基，性質(zhì)極其活潑，反應(yīng)速度快，毒性強(qiáng)，會對細(xì)胞有損傷，從而誘發(fā)疾病，加快衰老[11]。由圖2可知，陳醋多酚提取物和抗壞血酸具有良好的·OH清除活性，且濃度越高清除率越高。同樣地，將抗壞血酸與陳醋多酚提取物作對比，發(fā)現(xiàn)陳醋多酚提取物的·OH清除活性高于抗壞血酸。·OH清除率與抗壞血酸濃度仍呈線性關(guān)系，y=0.32x+5.2；而·OH清除率與陳醋多酚提取物濃度是非線性關(guān)系，y=16.85ln(x-36.41)。總體來講，陳醋多酚提取物的清除·OH 活性略高于抗壞血酸。

圖2 陳醋多酚提取物和抗壞血酸的·OH清除活性Fig.2 ·OH scavenging activity of mature vinegar polyphenol extract and ascorbic acid

2.3 抗疲勞活性

2.3.1 體質(zhì)量測定結(jié)果

經(jīng)過30 d的飼養(yǎng)，不論是陰性對照組(Ⅰ組)還是實(shí)驗(yàn)組(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)，體重均上升了8 g左右。由圖3可知，灌胃飼養(yǎng)前后，小鼠體重相差范圍在0.68～0.97 g之間，4組間體重增長無明顯差異(P>0.05)。

圖3 陳醋多酚提取物對小鼠體重的影響Fig.3 Effect of mature vinegar polyphenol extract on body weight of mice

2.3.2 負(fù)重游泳時(shí)間結(jié)果

由圖4可知，Ⅰ組小鼠平均負(fù)重游泳時(shí)間為30.36 min，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組小鼠平均負(fù)重游泳時(shí)間分別為50.46，55.35，56.73 min，與Ⅰ組相比，時(shí)間都顯著性延長(P<0.01)。結(jié)果表明，陳醋多酚提取物可有效延長小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間，即提高小鼠的抗疲勞能力[12]，即使是低劑量的Ⅱ組。

圖4 陳醋多酚提取物對小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響Fig.4 Effect of mature vinegar polyphenol extract on weight-bearing swimming time of mice

2.3.3 SUN含量

由圖5可知，Ⅰ組小鼠平均SUN含量為14.72 mmol/L，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組小鼠SUN含量分別為12.31，12.03，11.92 mmol/L，與Ⅰ組相比，SUN含量都顯著性減少(P<0.05)，但是隨著劑量的增加，SUN含量下降并沒有顯著性差異。SUN含量可以顯示機(jī)體運(yùn)動負(fù)荷適應(yīng)力，因?yàn)樵谶\(yùn)動時(shí)，糖原消耗完會開始消耗蛋白質(zhì)，產(chǎn)生血尿素氮(SUN)，若機(jī)體運(yùn)動適應(yīng)能力強(qiáng)，則SUN含量低[13]。所以，SUN含量結(jié)果表明陳醋多酚提取物能有效提高小鼠的運(yùn)動能力。

圖5 陳醋多酚提取物對小鼠SUN含量的影響Fig.5 Effect of mature vinegar polyphenol extract on SUN content of mice

2.3.4 肝糖原、肌糖原含量

由圖6可知，Ⅰ組小鼠平均肝糖原含量為80 mg/g，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組小鼠肝糖原含量分別提高了27.5%、42.5%、53.7%，肝糖原含量都顯著性提高(P<0.05或P<0.01)，隨著劑量的增加，肝糖原含量上升有顯著性差異。Ⅰ組小鼠平均肌糖原含量為25 mg/g，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組小鼠肌糖原含量分別提高了36%、60%、76%，肌糖原含量都顯著性提高(P<0.05或P<0.01)，隨著劑量的增加，肌糖原含量上升有顯著性差異。不難發(fā)現(xiàn)，陳醋多酚提取物對肝糖原和肌糖原的影響趨勢是一致的。運(yùn)動時(shí)，肌糖原被消耗盡，機(jī)體開始消耗肝糖原，隨著肝糖原含量的不斷減少，疲憊感隨之而來[14]。陳醋多酚提取物能夠?qū)Ω翁窃图√窃鹱饔茫瑥亩鴾p輕疲憊感。

圖6 陳醋多酚提取物對小鼠肝糖原和肌糖原含量的影響Fig.6 Effect of mature vinegar polyphenol extract on liver glycogen and muscle glycogen content of mice

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助提取法制備出陳醋多酚提取物，提取率高達(dá)95.72%，進(jìn)一步考察了陳醋多酚提取物的抗氧化活性和抗疲勞效果。DPPH 自由基清除活性、·OH清除活性結(jié)果表明陳醋多酚提取物具有良好的抗氧化效果，抗氧化能力與濃度相關(guān)，且略優(yōu)于抗壞血酸。陳醋多酚提取物表現(xiàn)出一定的抗疲勞功效，在沒有顯著影響小鼠體重的情況下能夠延長小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間，降低SUN含量，提高肝糖原、肌糖原含量，提高小鼠的運(yùn)動適應(yīng)能力。該研究為陳醋的高值化利用、擴(kuò)大其應(yīng)用范圍提供了理論依據(jù)。