綠色木霉前發酵工藝提高蘋果渣水溶性膳食纖維研究

朱 妞

(西安醫學院 公共衛生學院，西安 710021)

膳食纖維(DF)具有降低膽固醇、控制血糖、改善腸道功能紊亂、控制體重等一系列生理功能，對于人類健康有積極的預防作用[1-3]。全民健康是全民小康的重要前提，全民營養是全民健康的保證。膳食纖維作為第七營養素，是居民每日膳食中重要的營養素，在食品工業中占據重要的地位，可以廣泛應用于主食、肉制品、保健品、乳制品、飲料、保健食品、調味品、嬰幼兒食品等各個領域[4,5]。DF包含水溶性膳食纖維(SDF)和水不溶性膳食纖維(IDF)。二者的比例對膳食纖維的理化特性和生理功能影響較大[6,7]，SDF主要體現在控制血糖、降低膽固醇等代謝功能方面，IDF則通過一定的機械蠕動改善腸道功能。具有應用價值的DF應該至少含有10%以上的SDF[8]。我國的蘋果資源豐富，年產量大，陜西省是蘋果資源大省[9]。蘋果汁加工產生的廢棄物蘋果渣中含有豐富的膳食纖維，但是SDF不足，只占3%左右。通過微生物發酵改善蘋果渣膳食纖維的組成，提高SDF含量，才能更好體現膳食纖維的代謝功能特性[10]，真正變廢為寶，提升蘋果產業鏈附加值。

微生物發酵制備膳食纖維主要是利用菌種產生的纖維素酶分解纖維，提高SDF含量，目前主要采用的菌種是曲霉屬和木霉屬[11]。綠色木霉對人體無毒性，產纖維素酶活性非常高，降解效果好，且菌體繁殖快，被廣泛應用于食品發酵[12]。本試驗設計了綠色木霉前發酵和后發酵工藝處理蘋果渣膳食纖維。通過前發酵，綠色木霉在適宜的條件下培養，產生大量的生物酶；后發酵過程利用綠色木霉產生的生物酶酶解，改善蘋果渣膳食纖維組成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果渣：由渭南海升果業有限公司提供，清洗干燥后粉碎過40目篩；綠色木霉：沂源康源生物科技有限公司；磷酸二氫鉀、硫酸銨、硫酸鎂、氯化鈣：分析純，西安化學試劑公司；瓊脂、葡萄糖：市售。

1.2 儀器與設備

玻璃儀器：錐形瓶、離心管、量筒、試管等。

QE-200型萬能粉碎機 江陰市萬通藥化機械設備有限公司；HH2-型恒溫水浴鍋 北京化玻聯醫療器械有限公司；pHS-3C型精密pH計 上海大中分析儀器有限公司；JA5003型電子天平 上海精密科學儀器廠；WJ-2型電熱恒溫培養箱 上海和呈儀器制造有限公司；80001-10070型全溫型恒溫培養搖床 上海茸研儀器有限公司；JHT-DD型工作臺 上海樹立儀器儀表有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵劑制備

活化培養基采用馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，葡萄糖20 g，自然pH，加蒸餾水1 L，制成馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)平板；發酵培養基：蘋果渣原粉，磷酸二氫鉀6.5 g，硫酸銨6 g，硫酸鎂2.5 g，氯化鈣1.5 g，加蒸餾水1 L；發酵劑：在 PDA培養基中接種綠色木霉菌種，28 ℃條件下培養72 h。用無菌水洗下孢子，并震蕩稀釋。采用血球計數板計數，孢子含量在107～108CFU/mL[13]。

1.3.2 綠色木霉發酵制備蘋果渣膳食纖維

將一定量蘋果渣粉加水調制混勻后，裝入錐形瓶中，于121 ℃條件下滅菌處理20 min，迅速冷卻。按照試驗需要接入不同體積的發酵液，維持試驗設計條件進行前發酵培養。后發酵：調節pH為5.0，溫度50 ℃，繼續發酵48 h。前后二次發酵結束后加入95%乙醇進行醇沉后將濾渣烘干，粉碎過80目篩，即為蘋果渣膳食纖維粉。

前發酵工藝條件的確定，主要采用單因素試驗和正交試驗。考察料液比、發酵初始pH、接種量、培養溫度、培養時間等因素對SDF含量的影響，設計正交試驗確定最佳前發酵工藝參數。

1.3.3 膳食纖維計算方法

本試驗膳食纖維總含量和水溶性膳食纖維含量的測定采用酶-重量法[14]。

SDF含量=水溶性膳食纖維質量/總膳食纖維質量×100%。

(1)

1.3.4 膳食纖維持水力和膨脹力的測定方法

準確稱取1.0 g膳食纖維粉于100 mL燒杯中，加入50 mL蒸餾水，振搖，混勻后放置于25 ℃水浴1 h。使蘋果渣膳食纖維充分吸水后過濾瀝干，而后轉移到表面皿，稱重，采用公式(2)計算膳食纖維的持水力(g/g)。

(2)

準確稱取1.0 g膳食纖維粉于100 mL量筒中，加入50 mL蒸餾水，振搖，混勻后置于室溫條件，靜置24 h。采用公式(3)計算膳食纖維的膨脹力(mL/g)。

(3)

2 結果與分析

2.1 料液比的影響

準確稱取5.0 g蘋果渣粉于250 mL錐形瓶中，按照料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)加入相應的培養基，混合均勻，調節pH為6.0，接種8%綠色木霉發酵劑，32 ℃條件下發酵2 d。測定水溶性膳食纖維和總膳食纖維，計算SDF含量，結果見圖1。

圖1 料液比對SDF含量的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on SDF content

由圖1可知，料液比會對綠色木霉的繁殖產生一定的影響。料液比較小時，培養基中水分含量少，蘋果渣與綠色木霉接觸不充分，發酵效果不理想。料液比為1∶20時，綠色木霉獲得充足的水分，和蘋果渣發酵作用較為充分，產生充足的菌絲和酶，發酵效果較佳。隨著料液比的增加，過多的水分會減少發酵體系的氧氣，反而不利于綠色木霉菌體生長，同時也加大了后續處理的難度。

2.2 培養溫度的影響

準確稱取5.0 g蘋果渣粉，加入100 mL培養基，調節pH為6.0，接種8%綠色木霉發酵劑，在28，30，32，34，36 ℃的溫度下培養菌種2 d，計算SDF含量，結果見圖2。

圖2 培養溫度對SDF含量的影響Fig.2 Effect of culture temperature on SDF content

由圖2可知，適宜的溫度對綠色木霉的繁殖和發酵非常重要。32 ℃最適宜綠色木霉的繁殖，SDF含量達到最大值。溫度是影響微生物繁殖的重要因素，也影響酶的活性和各種生化反應的進行。溫度較低會抑制綠色木霉代謝產酶等活性，過高的溫度會減緩綠色木霉生長，減少酶的產生，SDF含量顯著降低。參考其他研究成果，綠色木霉適宜的溫度均在32 ℃左右，與該結論基本一致，因此后續試驗選擇最佳綠色木霉培養溫度為32 ℃。

2.3 發酵液初始pH的影響

準確稱取5.0 g蘋果渣粉，加入100 mL培養基，接種8%發酵劑，調節發酵液初始pH分別為5.7，6.0，6.3，6.6，6.9，于32 ℃條件下培養2 d，計算SDF含量，結果見圖3。

圖3 發酵液初始pH對SDF含量的影響Fig.3 Effect of initial pH value of fermentation broth on SDF content

由圖3可知，發酵液初始pH為6.0時，SDF含量達到最大值24.51%。之后隨著pH的增加，SDF含量不斷下降。一般而言，真菌適合在弱酸性條件下生存，偏酸性環境更加有利于綠色木霉的繁殖。

2.4 綠色木霉接種量的影響

準確稱取5.0 g蘋果渣粉，加入100 mL培養基，調節發酵液初始pH 為6.0，分別接種6%、8%、10%、12%、15%綠色木霉，在32 ℃條件下培養2 d，計算SDF含量，結果見圖4。

圖4 綠色木霉接種量對SDF含量的影響Fig.4 Effect of inoculation amount of Trichodermaviride on SDF content

由圖4可知，隨著綠色木霉接種量的增加，SDF含量呈現一定的上升趨勢。隨著接種量的增加，培養基中綠色木霉比例增加，產生更豐富的酶，發酵效果有所提升。底物濃度一定的情況下，接種量的進一步增加會導致營養物質不夠，繼而受到限制。因此，后續增加接種量，SDF含量增加不明顯，反而因為競爭性導致產酶力受到限制，SDF含量有下降趨勢。

2.5 培養時間的影響

準確稱取5.0 g蘋果渣粉，加入100 mL培養基，調節發酵液初始pH 為6.0，接種8%綠色木霉發酵劑， 在32 ℃條件下分別培養40，48，56，64，72 h，計算SDF含量，結果見圖5。

圖5 培養時間對SDF含量的影響Fig.5 Effect of culture time on SDF content

由圖5可知，隨著培養時間的延長，SDF含量整體呈現上升的趨勢。主要原因是菌種進入培養基后繁殖有一定的滯后性，隨著時間延長至64 h時，綠色木霉產酶活力最強，進入對數生長期，產生最大量的各種酶類。在后發酵階段，這些酶與蘋果渣膳食纖維充分作用，提高了SDF含量。時間繼續延長，積累的一些生化反應產物反而影響水溶性膳食纖維的含量。

2.6 正交試驗

按照表1進行四因素三水平正交試驗設計，在培養溫度為32 ℃的條件下，考察前發酵過程料液比、發酵液初始pH、綠色木霉接種量、培養時間4個因素對SDF含量的影響。后發酵工藝條件同上，保持不變。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test

按照試驗設計，完成9組試驗，計算相應的SDF含量，正交試驗結果分析見表2。

表2 L9(34)正交試驗結果分析表Table 2 Analysis of L9(34) orthogonal test results

由表2的正交試驗結果可知，因素影響的主次順序為D>B>C>A，培養時間對綠色木霉的生長、產酶影響最大，64 h為菌種對數生長期，對后發酵提供的酶最為充足，SDF含量顯著增加。由K值可以得出優組合為A1B2C2D2，即料液比1∶15(g/mL)，發酵液初始pH 6.0，綠色木霉接種量10%，培養時間64 h。此組合為試驗序號2，在此條件下平行試驗3次，取平均值，膳食纖維總得率為79.8%，SDF含量為30.27%，該膳食纖維的持水力為7.54 g/g，膨脹力為8.62 mL/g，比原蘋果渣粉(持水力2.19 g/g，膨脹力2.87 mL/g)有了很大提升。

2.7 發酵前后蘋果渣膳食纖維結構對照

將蘋果渣原粉和通過綠色木霉二次發酵所得的改性膳食纖維產品通過電鏡掃描，比較二者結構的改變，結果見圖6。

圖6 蘋果渣發酵前后掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron micrograph of apple pomace before and after fermentation

由圖6對比發現，蘋果渣原粉的顆粒較大，表面光滑規整，形狀規則，幾乎呈現圓球形。通過綠色木霉二次發酵后，膳食纖維表面粗糙，更加細膩，呈現蜂窩狀。結合SDF含量的增加，分析原因可能是通過發酵改性使蘋果渣膳食纖維結構更加疏松，水溶性增加，體現一定的立體結構，從而表現出更好的持水力和膨脹力。

3 小結

采用綠色木霉前發酵和后發酵二次發酵工藝對蘋果渣進行發酵處理，極大地提高了蘋果渣膳食纖維的SDF含量，總膳食纖維得率達79.8%，水溶性膳食纖維(SDF)含量可達到30.27%。此類研究報道很少，通過試驗發現對綠色木霉二次發酵對蘋果渣SDF含量的提升效果較佳。

通過單因素試驗和正交試驗對綠色木霉前發酵工藝進行研究，得出最佳工藝條件為：培養溫度32 ℃、料液比1∶15(g/mL)、發酵液初始pH 6.0、接種量10%、培養時間64 h，后發酵條件為發酵溫度50 ℃、pH 5.0、發酵時間48 h條件不變。后續可以進一步研究后發酵工藝條件，尋找微生物發酵制備膳食纖維的優化工藝路線。

綠色木霉二次發酵制備的蘋果渣膳食纖維持水力為7.54 g/g，膨脹力為8.62 mL/g，比原蘋果渣粉性能有了很大提升，后續應對改性膳食纖維粉進行理化特性全面分析，為改性膳食纖維在食品工業中的應用提供了參考依據。