香辣仔鵝特定腐敗菌的分離及鑒定

彭先杰，陳崇艷，袁玉梅，于躍，劉永明，袁先鈴

(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000)

鵝肉富含人體多種必需氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)、煙酸、微量元素鈣、鐵、磷等[1]，有少量的脂肪，且99%以上為不飽和脂肪酸，具有較高的食用價值和藥用價值[2]，是受人矚目的營養(yǎng)食品[3]。鵝屬草食性家禽, 有抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣、產(chǎn)品綜合利用價值高等特點(diǎn)[4]，其中，鵝肉干物質(zhì)含量比鴨肉高7.8%，比雞肉高20.5%；0.1 kg鵝肉產(chǎn)能是鴨的1.3倍，雞的2.6倍[5]。2009年，中國肉鵝出欄量約為6.05億只[6]；2012年，出欄數(shù)量約為6.29億只，占世界總量的90%以上[7]，2014年約為9.0億只[8]，我國的鵝飼養(yǎng)量位居世界首位[9]，在國際市場上有巨大的消費(fèi)潛力。

香辣仔鵝屬于熟肉制品(GB 2726—2016)，鵝肉具有高蛋白、低膽固醇、多不飽和脂肪酸等特點(diǎn)，肉質(zhì)細(xì)嫩，口味獨(dú)特，營養(yǎng)豐富。香辣仔鵝經(jīng)過一系列的干制、蒸煮、熏烤、醬鹵等加工工藝后，可直接供人食用[10-12]，但是在加工、運(yùn)輸、貯藏以及銷售過程中因高水分、高蛋白等極易被微生物污染，導(dǎo)致腐生葡萄球菌、溶酪大球菌、芽孢桿菌、單增李斯特氏菌、肉桿菌屬群、梭菌屬群、沙門氏菌屬、腸桿菌及乳酸菌等微生物含量超標(biāo)[13-21]，甚至?xí)?dǎo)致食源性病菌感染引起各種疾病以及食物中毒[22-24]，從而危害人體健康。

隨著時代的快速發(fā)展，人們對肉類品質(zhì)的要求越來越高，開展冷吃鵝肉加工質(zhì)量安全關(guān)鍵技術(shù)等研究勢在必行。本實(shí)驗(yàn)以香辣仔鵝為研究對象，分析其貯藏期間微生物變化，將其分離純化，通過菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮確定特定腐敗菌。根據(jù)生理生化方法研究特定腐敗菌的生物學(xué)特性，結(jié)合分子生物學(xué)進(jìn)行菌株鑒定，為如何抑制冷吃鵝肉中特定腐敗菌的生長提供了理論基礎(chǔ)，也為其他熟肉制品的保鮮技術(shù)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鵝肉、香辛料等：購于宜賓市沃爾瑪超市。

香辣仔鵝制備過程：鵝肉切丁、腌制、炒制、冷卻、裝袋、抽真空(接觸性工具皆用75%酒精消毒)。

無水葡萄糖、氯化鈉、三氯乙酸、氧化鎂、結(jié)晶紫、草酸銨、α-萘酚、氫氧化鉀、可溶性淀粉、乳糖、甘露醇、蔗糖、檸檬酸鈉、磷酸二氫銨、對二甲基氨基苯甲醛、硝酸鉀、過氧化氫、磷酸二氫鉀、苯酚紅等分析純；胰蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂、石蠟油、牛肉膏、D-麥芽糖、明膠、尿素等生物試劑；甲基紅、溴百里酚藍(lán)等指示劑。

1.2 儀器與設(shè)備

LS-75HD立式壓力蒸汽滅菌器(配備國家專利安全連鎖裝置及超壓自動保護(hù)功能) 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；Kje1tec 8400全自動凱氏定氮儀(配備專用計算機(jī)軟件管理及進(jìn)樣器系統(tǒng)) 福斯分析儀器公司；UV-8000ST觸屏版雙光束紫外可見分光光度計(配置雙光路、雙光束光學(xué)系統(tǒng)及高性能進(jìn)口光柵) 上海元析儀器有限公司；ABI 3730XL測序儀(配置雙光束雙側(cè)激光激發(fā)，光柵分光裝置和后置超薄CCD檢測成像系統(tǒng)) 美國基因儀器公司；2720 Thermal Cycler PCR儀(配置VeriFlexTM模塊控制系統(tǒng)) 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株腐敗特性實(shí)驗(yàn)

菌株的分離與篩選：在無菌環(huán)境條件下，取37 ℃恒溫培養(yǎng)15 d的3袋變質(zhì)香辣仔鵝產(chǎn)品10 g(產(chǎn)品出現(xiàn)哈敗味，肉質(zhì)明顯變軟)，制成10-1～10-7的菌懸液，選擇最后5個稀釋度的菌液接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂(beef extract peptone agar)平板；挑選培養(yǎng)基中較典型的菌落于平板計數(shù)瓊脂(plate count agar，PCA)平板上劃線，直至分離得到純菌落，將分離的菌株編號為A～H。

菌株的復(fù)篩：將純化后的A～H菌株制成菌懸液，分別取1 mL加入滅菌后的無菌香辣仔鵝中，37 ℃培養(yǎng)24，48 h；測定菌落總數(shù)(total volatile basic nitrogen)和揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)(測定3次取平均值)[25，26]，確定菌株的致腐能力，將有較強(qiáng)致腐能力的菌株作為特定腐敗菌。

1.3.2 特定腐敗菌的生理生化鑒定

對特定腐敗菌分別進(jìn)行革蘭氏染色[27]、生長溫度與耐熱性試驗(yàn)、V-P(乙酰甲基甲醇)試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、碳源利用試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、尿素水解試驗(yàn)、石蕊牛乳試驗(yàn)，以上試驗(yàn)步驟參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[28]。

1.3.3 特定腐敗菌的分子生物學(xué)鑒定

將特定腐敗菌在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)體系中擴(kuò)增。16S rDNA基因擴(kuò)增引物上、下游序列分別為：5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，5′-GGTTACCTTGTTACGACT-3′。 PCR反應(yīng)體系：25 μL的I5 Mix，1 μL的PF(10P)，1 μL的PR(10P)，1 μL的Genomic DNA，22 μL的dH2O。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃、5 min，98 ℃、10 s，53 ℃、15 s，72 ℃、20 s(98，53，72 ℃共35個循環(huán))，72 ℃、5 min，于4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測及膠回收，送成都肇科生物科技有限公司進(jìn)行測序鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)測序鑒定結(jié)果，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST對比分析，找到相似菌屬(種)后，用MAGE 7軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗細(xì)菌分離純化結(jié)果

2.1.1 腐敗菌株的分離

經(jīng)過多次平板劃線分離純化，總共得到8種菌株，命名A～H，觀察平板上的菌落形態(tài)，結(jié)果見表1。

表1 分離菌株的菌落形態(tài)Table 1 The colony morphology of isolated strains

續(xù) 表

2.1.2 菌落總數(shù)測定結(jié)果

在恒溫恒濕培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24，48 h，各個菌株的菌落總數(shù)平均值測定結(jié)果見表2。

表2 分離菌株的菌落總數(shù)Table 2 Total bacterial colony number of isolated strains

食品菌落總數(shù)是用來判斷食品的新鮮度、食品的衛(wèi)生質(zhì)量以及該食品被細(xì)菌污染的程度，它可以反映食品在生產(chǎn)、運(yùn)輸及銷售過程中是否符合國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，菌落總數(shù)的多少在一定程度上表示著食品質(zhì)量的優(yōu)劣(GB 4789.2—2016中，細(xì)菌的菌落總數(shù)≤105CFU/g)[29,30]。由表2可知，培養(yǎng)24 h，A，C，D，H菌株的菌落總數(shù)超標(biāo)；培養(yǎng)48 h，菌株的菌落總數(shù)全部超標(biāo)。

2.1.3 TVB-N測定結(jié)果

TVB-N是指動物性食品在腐敗過程中，由于酶和細(xì)菌的作用，使蛋白質(zhì)分解，并產(chǎn)生氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)[31]。此氨及胺類堿性物質(zhì)具有揮發(fā)性，其含量的高低反映了氨基酸被破壞的多少，含量越高，氨基酸被破壞的越多，營養(yǎng)價值也隨之變低，揮發(fā)性鹽基氮值是反映動物性食品新鮮程度的指標(biāo)[32]。由表3可知，加入樣品后，菌株揮發(fā)性鹽基氮值都增加，A，C，D，H菌株的TVB-N值明顯增加。

表3 分離菌株的TVB-N值Table 3 TVB-N content of isolated strains

通過菌落總數(shù)和TVB-N的測定可知，A，C，D，H菌株對產(chǎn)品的致腐能力更明顯，因此將A，C，D，H菌株作為香辣仔鵝的特定腐敗菌。

2.2 特定腐敗菌的生理生化鑒定結(jié)果

表4 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of physiological and biochemical experiments

續(xù) 表

根據(jù)目的菌株的形態(tài)和生理生化結(jié)果進(jìn)行初步鑒定，對比《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[33]，A，C，D的菌體為球狀，菌落不透明，均為革蘭氏陽性細(xì)菌，且接觸酶陽性，產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣，不產(chǎn)生吲哚，能將硝酸鹽還原，能分解尿素，初步得到A，C，D均為葡萄球菌屬的一種。H菌體為桿狀，菌落形狀不定形，邊緣不規(guī)則，不透明，且色暗，產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣，V.P.為陽性，不產(chǎn)生吲哚，接觸酶陽性，能水解淀粉、還原硝酸鹽，是革蘭氏陽性細(xì)菌，且能還原石蕊牛奶，初步判定為枯草芽孢桿菌。

2.3 特定腐敗菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

菌株A，C，D，H的150 V、100 mA、20 min瓊脂糖電泳圖見圖1。

圖1 菌株A，C，D，H的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of strains A,C,D,H

由圖2可知，菌株A是腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)，菌株C是巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)，菌株D是雞葡萄球菌(Staphylococcusgallinarum)，菌株H是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

圖2 特定腐敗菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of specific spoilage bacteria

2.4 小結(jié)

菌株A為Staphylococcussaprophyticus，是傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中普遍存在的一種微生物[34]，Lee等[35]也在韓國高鹽發(fā)酵海產(chǎn)品jeotgal中發(fā)現(xiàn)腐生葡萄球菌。其可引起泌尿生殖道感染、腐生葡萄球菌肺炎等細(xì)菌性感染[36,37]。García等[38]在馬食中添加魔鬼魚和腐生葡萄球菌，能有效替代玉米飼料，減少溫室氣體排放。

菌株C為Staphylococcuspasteuri，其最初是由法國巴斯德研究所發(fā)現(xiàn)并命名[39]，其能高效降解甲胺磷[40]，且發(fā)酵液中含有D的一種可降解類胡蘿卜素的酶[41]，能降低對食品的污染[42]等。Hong Jisoo等[43]研究得出StaphylococcuspasteuriRSP-1能產(chǎn)生巴氏菌素，無細(xì)胞上清液對葡萄球菌有很強(qiáng)的抗菌活性。巴氏葡萄球菌TS-82可聯(lián)合釀酒酵母發(fā)酵沙棘果酒催化類胡蘿卜素，降解產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)[44]。

菌株D為Staphylococcusgallinarum，其最初由Devriese等人報道[45]，其一般只感染家禽等動物，對人的感染至今罕見報道，只在國外發(fā)現(xiàn)一例[46]。在原料為50 g酵母提取物I-1、45 g CaCl2I-1和5 g麥芽糖I-1的培養(yǎng)基中，能通過Staphylococcusgallinarum制備gallidermin[47]，且與最佳供養(yǎng)條件相比，氧供給量下降65%，gallidermin增長50%以上[48]。

菌株H為Bacillussubtilis，是芽孢桿菌屬的一種，在植物和土壤的表面普遍存在，是植物體內(nèi)常見的內(nèi)生菌，其不污染環(huán)境，且對人畜無毒無害[49]。因其具有生理特征多樣、耐熱、抗逆性強(qiáng)、無致病性、不易產(chǎn)生抗藥性、極易分離培養(yǎng)、可產(chǎn)多種抗菌素和酶的特點(diǎn)，應(yīng)用十分廣泛，可應(yīng)用于食品發(fā)酵、防治植物病害、防治畜禽疾病、凈化養(yǎng)殖環(huán)境等[50]，曾在郫縣豆瓣[51]、發(fā)酵甜面醬[52]中分離出枯草芽孢桿菌。

3 結(jié)論

菌株A是G+菌，在鏡檢下菌體形狀為球狀，兼性厭氧，不產(chǎn)芽孢，接觸酶陽性，可還原硝酸鹽，最適生長溫度為30～37 ℃，是腐生葡萄球菌。菌株C是G+菌，在鏡檢下菌體形狀為球狀，兼性厭氧，不運(yùn)動，不產(chǎn)芽孢，接觸酶陽性，可還原硝酸鹽，最適生長溫度為30～37 ℃，是巴氏葡萄球菌。菌株D是G+菌，在鏡檢下菌體形狀為球狀，兼性厭氧，不產(chǎn)芽孢，接觸酶陽性，可還原硝酸鹽，最適生長溫度為30～37 ℃，是雞葡萄球菌。菌株H是G+菌，在鏡檢下菌體形狀為直桿狀，接觸酶呈陽性，嗜溫、產(chǎn)芽孢、好氧，是枯草芽孢桿菌。

腐生葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、雞葡萄球菌及枯草芽孢桿菌是存在于香辣仔鵝中的特定腐敗菌，其中枯草芽孢桿菌的致腐能力略強(qiáng)于巴氏葡萄球，其次為腐生葡萄球菌和雞葡萄球菌。香辣仔鵝中的腐生葡萄球菌可能來源于人體與產(chǎn)品的接觸；巴氏葡萄球菌和雞葡萄球菌可能來源于鵝肉本身；枯草芽孢桿菌是常見的食品致腐菌，也是冷吃兔的特定腐敗菌。在香辣仔鵝的工業(yè)化生產(chǎn)中，可以通過優(yōu)化鵝肉來源、減少人體接觸頻率、增加滅菌過程、創(chuàng)造無菌包裝條件等措施，抑制特定腐敗菌的生長，進(jìn)而延長產(chǎn)品的貨架期。