基于液相色譜-質譜聯用及19F核磁成像技術測定一種新型氟類化合物

何芳菲 黃平升 王 婷 王東亮 王昱青*

(1.國家納米科學中心，北京 100090；2.中國醫學科學院北京協和醫學院生物醫學工程研究所，天津 300192)

19F原子是一種擁有100%自然豐度的原子，磁敏感率約為1H原子的83%，在動物體內含量很少(大部分存在于牙齒及骨骼中)，因此，19F原子幾乎不會受到背景噪聲干擾，非常適合應用于核磁成像[1]。鑒于這些優勢，國內外都在積極開發基于19F各種類型的MRI探針，用于體外和體內的生物學和病理學方面的診斷和治療[2]，如擁有穩定C-F鍵的全氟化碳類探針、血管或腫瘤組織靶向19F探針、刺激反應性19F探針、具有酶活性的19F探針等，這些探針都是以19F原子為核磁成像核[2-5]。本團隊新合成了一種19F核磁成像基團：N-(2-甲基丙烯酸乙酯)-N-(3,3,3-三氟丙基)-N-甲基甘氨酸(CBF3)，其溶解狀態下的分子式為C12H19F3NO4+，分子量為298.1[6]。

CBF3具有超親水性、分子量小、單分子含氟原子數量較高等優良特點[6]。通過19F進動頻段利用19F核磁成像技術可以直接對CBF3進行成像[6]。19F核磁成像依賴于CBF3的單位濃度，由于該化合物為單分子結構，每個分子攜帶3個氟原子，因此當組織中CBF3的濃度達到一定高度后，采用19F核磁成像方法能夠獲得特異性良好的CBF3生物分布，并計算出不同臟器組織中CBF3的體積含量。

但小分子CBF3在小鼠體內代謝較快，19F核磁成像只能顯示出該化合物在濃度含量較高組織的成像分布結果，而血液中CBF3的濃度達不到核磁成像檢測限，無法通過成像方法對CBF3的血藥濃度進行定性及定量分析。因此，還需要建立一套可靠的CBF3血藥濃度的檢測方法，以獲得關于該物質的更多藥物代謝信息。液相色譜-質譜聯用技術能夠將對小分子化合物進行快速精確的檢測，且對于微量檢測有很高的靈敏度[7]，因此非常適用于定量分析血清中低濃度的CBF3。通過超高效液相色譜可將目標組分從復雜的血清萃取液中快速、有效分離，多離子掃描模式(MRM)可對碎片離子進行特定篩選，從而對目標化合物進行準確的定性、定量分析[7,8]。因此，本研究利用液相色譜-質譜聯用技術，建立了CBF3在小鼠血清萃取液中的色譜、質譜分析條件和標準曲線，并進行提取回收率、精密度等方法驗證工作。此外，通過給藥后5個不同時間點的19F核磁成像結果及液質定量分析結果，對CBF3在小鼠體內主要代謝分布的臟器及血藥濃度進行了研究與探索。

1 材料與方法

1.1 材料

CBF3由中國醫學科學院北京協和醫學院生物醫學工程研究所提供，分子式為C12H19F3NO4，結構式如圖1。

圖1 CBF3的分子結構式

1.2 試劑與儀器

乙腈(LC-MS級，美國Fisher公司)；甲酸(上海Aladdin試劑公司)；雙蒸水(香港屈臣氏集團有限公司)；LCMS-8050液相色譜-質譜聯用儀(日本島津公司)；BioSpec70/20USR小動物核磁共振成像儀(德國Bruker公司)；Allegra 64R 離心機(美國BeckmanCoulter公司)；渦旋混合器(國產)；微孔濾膜(0.22μm，天津Agela公司)。

1.3 溶液配制

CBF3儲備液：精確稱量1mg CBF3標準品粉末，雙蒸水定容于100mL容量瓶中，0.22μm濾膜過濾，于4℃保存，備用。

空白基質：EP管取適量健康小鼠血清，加入4倍體積乙腈，渦旋1min充分混勻，4℃離心10分鐘，4000r/min，取上清，0.22μm濾膜過濾，雙蒸水稀釋100倍，備用。

標準工作溶液：準確移取適量上述儲備液，用空白基質稀釋，分別配制成 10、50、100、200、500、1000μg/L的CBF3溶液，混勻備用。

質控樣品：將上述CBF3儲備液用空白基質稀釋成相應濃度，配成質控品。質控樣品包括低濃度(20μg/L)、中濃度(200μg/L)、高濃度(400μg/L)。

1.4 實驗條件

色譜分離條件：InertSustainBio C18 HP色譜柱(2.1×150mm，3μm，島津公司)；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫；洗脫程序0.01～5min，30%～90% B；5～6min，90% B；6.01～8min，30% B；流速0.2ml/min；進樣體積1μL，運行時間8min。

電噴霧質譜條件(ESI-MS)：霧化氣流量：3L/min；接口溫度：300℃；DL溫度250℃，干燥氣流量10L/min。檢測模式：正離子掃描模式、多重反應監測(MRM)。離子對選擇及電壓優化結果見表1。

表1 CBF3的離子對選擇、碎片離子結構與電壓優化

1.5 CBF3血藥濃度檢測

健康Balb/c小鼠5只，體重均為15g，3%戊巴比妥腹腔注射麻醉。CBF3粉末配制為100mg/mL的注射液100μL，尾靜脈注射入小鼠體內，分別于15min、30min、45min、90min、120min取血，非抗凝全血靜置1h，4℃離心8分鐘，3000r/min，取上清。

蛋白沉淀處理：100μL血清加入400μL乙腈，渦旋混勻2min，4℃離心10分鐘，4000r/min，雙蒸水稀釋100倍，0.22μm 濾膜過濾，LC-MS分析。

1.6 CBF3活體19F核磁成像

健康Balb/c小鼠1只，體重為15g，3%戊巴比妥腹腔注射麻醉。CBF3粉末配制為100mg/mL的注射液100μL，尾靜脈注入小鼠體內，放入19F/1H雙頻鳥籠線圈中，選用SE序列在注射后15min、30min、60min、90min、120min時間點對小鼠進行活19F核磁成像，檢測CBF3的體內分布。成像參數如下：TE/TR = 1.88/3000 ms，FA = 90°，FOV = 50×50 mm，MTX = 100×100， slice thickness = 4 mm，slice number = 4，NEX = 10。1H背景選用SE序列，參數如下：TE/TR = 5.97/300 ms，FA = 90°，FOV = 50×50 mm，MTX = 256×256，slice thickness=1mm，slice number=16，NEX=2。

肝臟、腎臟和膀胱的CBF3時間-體積分布計算方法如下：選取活體成像時背景噪聲的平均SI為閾值，計算臟器內高于閾值的體素點數量(voxel number)，然后乘以每個體素大小(voxel size=1mm3)，即可得到臟器內高于閾值的CBF3體積。

2 結果與討論

2.1 CBF3液相色譜-質譜檢測結果

2.1.1標準曲線、線性范圍及定量下限

選擇離子對298.1>113.1建立標準曲線，取1.3中配制的標準工作溶液進行LC-MS/MS在線分析，以CBF3峰面積為縱坐標，CBF3濃度為橫坐標，進行線性擬合和定量分析。結果表明在10-1000μg/L濃度范圍內，CBF3峰面積與濃度呈良好線性關系，線性方程為f(x)=48539.3×x+177818，相關系數(R)為0.995，定量下限為10μg/L。

2.1.2精密度與提取回收率

采用低、中、高3個不同濃度的質控樣品，分別連續進樣5次，進樣濃度由低到高，測定對應峰面積的標準偏差為日內精密度2.61%～5.04%。將3個濃度的質控樣品連續3日進行檢測，獲得日間精密度1.95%～8.58%。取CBF3儲備液加入小鼠血清，經過上述蛋白沉淀處理，加入空白基質稀釋，配成低濃度(20μg/L)、中濃度(200μg/L)、高濃度(400μg/L)3個濃度，與對應的質控樣品進行比較，得到的提取回收率在100.66%～103.63%(表1)，本實驗中樣品的提取方法對樣品定量檢測影響較小。

表2 低、中、高濃度組的CBF3精密度和提取回收率

2.1.3血藥濃度檢測結果

藥物注射小鼠后15min、30min、45min、90min、120min即時采血，采用1.5中所述方法處理樣品，液相色譜-質譜方法檢測，采用多重反應監測(MRM)模式和正離子掃描模式測得CBF3分子量為298.1，出峰時間2.71min，圖譜如圖2所示。定量檢測上述5個時間點樣品中CBF3的濃度，依次為282.2μg/L、162.26μg/L、68.3μg/L、20.9μg/L、13.5μg/L。

圖2 藥物注射后CBF3樣品的MRM色譜圖(A1-A5)和正離子掃描質譜圖(B1-B5)

2.2 19F核磁成像結果

藥物注射一段時間內，采用19F核磁成像技術能夠清晰地采集到CBF3在小鼠肝臟、腎臟和膀胱中的成像信號，說明該化合物具有比較穩定的成像性能，同時通過CBF3時間-體積分布計算，發現該化合物在小鼠體內擴散較快，一部分CBF3通過肝臟代謝，絕大部分經過腎臟代謝，隨尿液大量蓄積在膀胱中，最終通過尿液排出體外。圖3為小鼠肝臟CBF3成像結果，從15min到60min，高于閾值的CBF3體積增加，CBF3在肝臟內累積；從60min到120min，CBF3在肝臟內含量下降。圖4為小鼠腎臟CBF3成像結果，從15min到30min，高于閾值的CBF3體積增加，CBF3在腎臟中的含量增加；從30min到120min，腎臟內CBF3體積沒有明顯變化趨勢。圖5為小鼠膀胱CBF3成像結果，從15min到120min，高于閾值的CBF3體積明顯增加，CBF3隨尿液在膀胱內迅速累積。

圖3 小鼠肝臟中CBF3 的19F核磁成像信號強度圖和分布體積折線圖

圖4 小鼠腎臟中CBF3 的19F核磁成像信號強度圖和分布體積折線圖

圖5 小鼠膀胱中CBF3 的19F核磁成像信號強度圖和分布體積折線圖

3 結論

本研究建立了一種快速、靈敏、便捷的方法定量檢測CBF3的血藥濃度，通過該方法測得CBF3的血藥濃度在小鼠尾靜脈給藥45分鐘后迅速下降，在90分鐘后基本代謝完全。同時，還建立了一種直觀、清晰的19F核磁成像方法以檢測CBF3在小鼠肝、腎和膀胱的代謝情況。液相色譜-質譜聯用檢測技術和19F核磁成像技術相結合能夠對CBF3這類小分子氟化物進行全面有效的檢測，其中核磁成像方法適用于高濃度CBF3全身分布的定性研究，液相色譜-質譜聯用法可以檢測到核磁成像檢出限以下的血液藥物濃度情況，兩種方法互補有助于共同闡釋該類氟化物進入動物體內的代謝分布。在未來進一步研究中，我們將完善以CBF3為核心的19F核磁探針，通過多分子聚合或連接靶向多肽等方法，適當增加其在體內的駐留時間及靶向性，并進一步開發適合的檢測方法。