酵母菌強化發酵郫縣豆瓣甜瓣子的研究

胡廷，范智義，張其圣,3，楊國華，李恒,3*

(1.四川省食品發酵工業研究設計院，成都 611130；2.四川省丹丹郫縣豆瓣集團股份有限公司，成都 611732；3.四川東坡中國泡菜產業技術研究院，四川 眉山 620020；4.成都市丹丹川菜調味品產業研究院有限公司，成都 611730)

郫縣豆瓣醬味辣香醇，醬香濃郁，具有悠久的歷史，素有“川菜之魂”的美稱，是川菜調味品的核心之一，其主要原料由發酵甜瓣子和椒醅混合而成，其中甜瓣子發酵產生的揮發性風味物質對豆瓣醬的主要風味品質起關鍵性作用[1]。傳統郫縣豆瓣發酵至少需要2年才能達到理想的風味，周期長，效率低，因此，工業發酵中常添加強化菌劑(酵母菌、米曲霉、嗜鹽菌和植物乳桿菌等)以縮短生產周期，同時增強發酵風味[2]。酵母菌是傳統發酵調味品中重要的功能菌，酵母代謝過程中可產生醇、酯、酚、醛以及呋喃等多種揮發性風味成分，賦予產品濃郁的風味。Yan等[3]在百合米酒中添加產香酵母(WickerhamomycesanomalusHN006)從而獲得更多的酯、游離脂肪酸、醇、醛、酮、烯烴、揮發性酚和噻唑，香味及感官均獲得了改善和提升。另有研究表明，魯氏接合酵母對葡萄糖醛酸、乙酸乙酯、α-酮異戊酸脂、α-酮異己酸酯等其他多種風味化合物的形成有關[4,5]。傳統發酵調味品中接入酵母菌強化發酵，是改善產品風味的常用手段，尤其是在醬油行業中，產香酵母的添加已成為其釀制工藝必不可少的一部分[6]。

本研究從郫縣豆瓣醬中分離篩選性狀優良的強化酵母菌株，測定強化發酵甜瓣子還原糖、總酸和氨基酸態氮、氨基酸組成以及揮發性風味物質等理化指標，通過強化發酵甜瓣子以提高產品的風味品質，實現高品質郫縣豆瓣的生產。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

實驗室前期從郫縣豆瓣中篩選獲得一株具有產香特性的菌株，經鑒定為魯氏接合酵母菌，編號為郫釀J028。

1.1.2 YM培養基

酪蛋白胨5 g，麥芽浸粉3 g，葡萄糖10 g，酵母浸粉3 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL。將篩選的強化酵母菌接種于含鹽量16%的YM培養基中，置于厭氧密封罐中30 ℃厭氧培養。

1.2 試劑與儀器

氯化鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸、98%濃硫酸、重鉻酸鉀、乙醇、36%～38%甲醛溶液、3,5-二硝基水楊酸等(均為分析純)：成都科龍化工有限公司；4-甲基-2-戊醇(色譜純)：美國Sigma公司；甲醇(色譜純)：重慶川東化工集團有限公司；YM培養基：青島海博生物科技有限公司。

2.5 L AnaeroGenTM厭氧培養袋、厭氧指示劑、厭氧培養罐 生工生物工程(上海)股份有限公司；固相微萃取頭及手動進樣手柄 北京八方世紀科技有限公司；DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司；GCMS-TQ8040氣質聯用儀 日本島津儀器公司；Agilent J & W氣相色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm) 美國安捷倫公司；全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；紫外分光光度計 上海欣茂儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母菌劑制備

將篩選所得魯氏接合酵母(郫釀J028)進行凍干，凍干菌劑呈乳白色粉末狀，所得酵母活菌數達1.5×1010CFU/g。

1.3.2 酵母菌強化發酵甜瓣子

將30%的食鹽水與郫縣豆瓣成曲按1∶1(m/m)混合均勻，并加入郫釀J028凍干菌劑(接種量約合106CFU/g)，30 ℃密封發酵，并在發酵第0，2，4，6，13，20，27，34天采集樣品，保存于-4 ℃，用于后續分析研究。

1.3.3 甜瓣子中還原糖測定

采用DNS光度法測定發酵甜瓣子中的還原糖含量[7]，取葡萄糖標準液(1 mg/mL)配成不同濃度的反應液，分別加入DNS試劑1.5 mL，540 nm測定各反應液的吸光度，以吸光度值為縱坐標，反應液中葡萄糖含量(mg)為橫坐標，繪制標準曲線。

稱取破碎后的樣品5.0 g，加蒸餾水定容至50 mL，40 ℃水浴加熱 30 min，離心取上清液，作為樣品測定液。取1 mL樣品測定液，加入1 mL蒸餾水和1.5 mL DNS 試劑，混勻后沸水浴5 min，冷卻至室溫后加蒸餾水定容至25 mL，搖勻，于540 nm處測定吸光度。以蒸餾水代替樣品測定液作為空白組。樣品中還原糖的含量根據下式進行計算：

C=A×D×100。

式中：C代表樣品中的還原糖含量(%)；A代表將樣品測定液的吸光度代入標準曲線求得的葡萄糖當量(mg)；D代表稀釋倍數。

1.3.4 甜瓣子中總酸和氨基酸態氮測定

甜瓣子中總酸(以乳酸計)與氨基酸態氮的測定參照GB 5009.235—2016 《食品中氨基酸態氮的測定》并略做修改[8]。稱取10.0 g研磨均勻的樣品于100 mL燒杯中，加入約40 mL蒸餾水充分攪拌煮沸5 min，用蒸餾水定容到100 mL，靜置，取上清液10 mL于200 mL燒杯中，加入60 mL蒸餾水搖勻，然后用0.1 mol/L的氫氧化鈉標準溶液滴定，當pH達到8.20后，記錄消耗的氫氧化鈉標準溶液的毫升數V1，在溶液中繼續加入甲醛溶液10 mL，攪拌均勻后靜置5 min，繼續滴定至pH為9.20，記錄加入甲醛后耗用氫氧化鈉標準溶液的毫升數V2，同時做空白試驗，記錄pH分別達到8.20和9.20時消耗氫氧化鈉標準溶液的毫升數V01和V02。

總酸根據下式進行計算：

氨基酸態氮根據下式進行計算：

1.3.5 甜瓣子中氨基酸測定

郫縣豆瓣甜瓣子中氨基酸的測定參考GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》進行測定[9]。

1.3.6 揮發性風味物質的測定

采用固相微萃取-氣質聯用(SPME-GC-MS)技術對其揮發性風味成分進行測定，測定結果采用NIST05譜庫檢索與人工圖譜解析共同確定，相對含量采用內標法進行定量分析。

1.3.6.1 SPME條件

稱取2.0 g研磨粉碎的甜瓣子樣品裝入固相微萃取瓶中，同時滴加2 μL(0.5 μg/mL)4-甲基-2-戊醇溶液作為內標物，混勻后于60 ℃預熱2 min，使用固相微萃取裝置(帶有50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取纖維)于60 ℃恒溫吸附50 min。

1.3.6.2 GC-MS條件

萃取完畢后，立即將固相微萃取纖維插入GCMS-TQ8040 氣質聯用儀，采用高分離度Agilent J & W氣相色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，以高純氦氣為載氣，柱流量為0.93 mL/min，不分流進樣，進樣口溫度250 ℃，升溫程序：柱箱初始溫度50 ℃，程序開始后以10 ℃/min升溫至85 ℃，保持1.5 min，以5 ℃/min升溫至100 ℃，保持1 min，以2.5 ℃/min升溫至175 ℃，保持1.5 min，以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持2 min。電離方式為EI電子源，離子源溫度230 ℃，掃描范圍35.0～350.0 m/z，電子轟擊能量70 eV，檢測器電壓 0.1 kV。

2 結果分析

2.1 強化發酵甜瓣子的還原糖

由圖1可知空白組甜瓣子和郫釀J028強化發酵組(以下簡稱強化組)甜瓣子在發酵1個月期間的還原糖變化情況。在郫縣豆瓣甜瓣子發酵過程中，還原糖含量總體呈現先增后減的趨勢，但空白組與強化組發酵中期(4～25 d)含量差異較大，其中空白組甜瓣子的還原糖在發酵前期不斷增加，由初始的0.79%增加到了發酵13 d的1.37%，之后逐漸下降至34 d的0.61%；強化組的還原糖含量由發酵初始時的0.76%增長到發酵2 d的1.16%后短暫維持，并從發酵6 d開始迅速下降至發酵13 d的0.57%，之后則趨于穩定。

圖1 強化發酵甜瓣子還原糖的變化Fig.1 Changes of reducing sugar in sweet beans by enhanced fermentation

還原糖作為微生物發酵的碳源，其含量高低直接影響微生物的生長，甜瓣子在發酵前期還原糖含量的增加主要源于制曲階段米曲霉分泌的淀粉酶對豆瓣中淀粉的水解作用，而在后期甜瓣子中還原糖含量的下降可能是由于發酵體系中各種微生物對糖的不斷消耗。與空白組甜瓣子相比，強化組的甜瓣子還原糖含量下降趨勢更早，變化更為劇烈，這可能是由于接入魯氏接合酵母提高了甜瓣子中酵母菌的初始含量，加速了發酵體系中還原糖的消耗。發酵6 d后，空白組的還原糖含量持續增加，明顯高于強化組，但在發酵34 d時，二者還原糖含量相近。總體來看，魯氏接合酵母強化發酵降低了甜瓣子發酵過程中還原糖的含量，還原糖濃度的變化一定程度上反映了微生物生長情況和強化發酵速度，對最終甜瓣子的還原糖含量影響不大。

續 表

續 表

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2.2 強化發酵甜瓣子的總酸

由圖2可知空白組甜瓣子和郫釀J028強化發酵組甜瓣子在發酵1個月內的總酸變化情況。發酵前4 d總酸增長較快，發酵中期(4～25 d)強化組的總酸含量略高于空白組，之后逐漸趨于同水平穩定。整體來看，兩組甜瓣子的總酸含量無明顯差異，變化趨勢相似，說明魯氏接合酵母對甜瓣子發酵過程中的總酸含量無顯著影響。

圖2 強化發酵甜瓣子總酸的變化Fig.2 Changes of total acid in sweet beans by enhanced fermentation

2.3 強化發酵甜瓣子的氨基酸態氮

由圖3可知空白組與郫釀J028強化發酵甜瓣子在發酵1個月期間的氨基酸態氮變化情況。隨著發酵時間的延長，甜瓣子中的氨基酸態氮含量不斷增加，空白組甜瓣子的氨基酸態氮含量由發酵初始時的0.25 g/100 g增加到了發酵34 d的0.66 g/100 g，強化組甜瓣子的氨基酸態氮由初始時的0.24 g/100 g增加到了發酵34 d的0.62 g/100 g，強化組與空白組氨基酸態氮含量呈現相同的變化趨勢，因此，甜瓣子發酵過程對氨基酸態氮含量無顯著影響。氨基酸態氮是反映豆瓣中氨基酸和小分子肽總體水平的重要指標[10]，其含量的高低影響豆瓣的品質及風味，郫縣豆瓣特有的鮮味柔和、風味協調的味感正是由于多種氨基酸和小分子肽的相互作用。

圖3 強化發酵甜瓣子氨基酸態氮的變化Fig.3 Changes of amino acid nitrogen in sweet beans by enhanced fermentation

2.4 強化發酵甜瓣子的氨基酸

氨基酸的種類反映了蠶豆瓣原料中蛋白質的氨基酸構成，郫縣豆瓣中的小分子呈味肽(如:鮮味肽、苦味肽、甜味肽等)賦予豆瓣鮮美濃郁的味感，以鮮味、甜味、苦味為主的游離氨基酸影響著豆瓣的整體風味[11]。強化發酵甜瓣子與空白組甜瓣子的氨基酸組成及含量見表1。

表1 強化發酵甜瓣子的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of sweet beans by enhanced fermentation

發酵甜瓣子含有16種常見氨基酸，組成全面，其中谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸和亮氨酸是甜瓣子發酵最主要的氨基酸，在強化組中含量分別為2.48，1.48，1.24，1.07 g/100 g，強化組與空白組氨基酸相對含量差異不大，這說明通過郫釀J028強化發酵活動對發酵體系中氨基酸組成的影響較小。此外，氨基酸主要來源于甜瓣子中蛋白質的降解以及酵母和其他微生物的自溶，發酵過程中，一些氨基酸被酵母用作營養物質，一些轉化為高級醇[12]，因此對揮發性風味物質含量可能有影響。

2.5 強化發酵甜瓣子的揮發性風味物質

根據GC-MS分析結果，郫縣豆瓣甜瓣子中共檢測出50種主要揮發性風味物質(見表2)，包括21種酯、9種醇、6種醛、6種雜環化合物、3種酚、3種羧酸和2種酮。董丹等[13]從不同發酵時期甜瓣子中共檢測出揮發性物質34種，占總檢出化合物的22.82%，包括酯類13種，醇類7種，醛酮類5種，酸類2種，酚類2種，其他化合物類5種, 其中，酯類所占比例最高，其次是醇類、酸類和酚類，與本研究結果相似。從郫釀J028強化發酵組中檢測到45種主要揮發性風味物質，相對含量總計25.00 ng/g，其主要揮發性風味物質的種類和含量均高于空白組(含有40種主要揮發性風味物質，總計10.60 ng/g)，其中，甜瓣子發酵酯類物質種類最多，強化組有21種，占比達36.20%，空白組有16種，占比為25.69%，醇類物質是主要的揮發性風味成分，醇類物質在強化組和空白組中占比均最高，分別達到45.62%和52.04%，這與Lin等的研究結果相似。

表2 強化發酵甜瓣子的揮發性風味物質分析Table 2 Analysis of volatile flavor components in sweet beans by enhanced fermentation

由圖4可知，酯、醇、醛和雜環化合物是構成發酵醬特征香氣的重要成分，除酮類物質外，強化組中的其他各類揮發性風味物質均顯著高于空白組，醇、醛、雜環化合物等揮發性成分較空白組相對含量增加了1倍以上，酯類物質較空白組增加了2倍多，酯類是醬香質量等級的重要指標，能賦予豆瓣醬獨特的花香和甜味，同時掩蓋氨基酸和脂肪酸的苦味和刺鼻氣味[14]。由此可見，通過郫釀J028強化發酵甜瓣子增加了發酵體系中風味物質的種類和含量，對郫縣豆瓣風味的增強與改善具有積極的影響。

圖4 強化發酵甜瓣子中各類揮發性風味成分對比Fig.4 Comparison of various volatile flavor components in sweet beans by enhanced fermentation

3 結論

利用郫釀J028進行甜瓣子強化發酵，結果顯示強化發酵的郫縣豆瓣甜瓣子的還原糖、氨基酸態氮、總酸和氨基酸組成等理化指標沒有發生明顯變化，但在發酵過程中還原糖動態含量變化存在差異，這可能是引起風味成分差異的原因，最終結果表明強化發酵可使甜瓣子發酵品質提高，獲得更加馥郁的風味。