基于HPLC 指紋圖譜的滇重樓野生品與移栽品鑒別和化學模式識別研究

王騫，江林蔓，周濃，母茂君，楊敏

1.大理大學藥學與化學學院，云南 大理 671000；2.重慶三峽學院生物與食品工程學院，三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶 404120

滇重樓Paris polyphyllavar.yunnanensis為重樓藥材的來源植物之一，主產(chǎn)于云南、貴州和四川等省區(qū)[1]。重樓廣泛用于中藥配方及中成藥原料，由于市場需求量較大，野生滇重樓被過度采挖，導致野生資源匱乏。野生滇重樓根莖生長緩慢，從種子萌發(fā)到可采摘入藥需10 年左右。滇重樓已被列為云南省30 種稀缺瀕危天然藥物之一。目前市場流通的滇重樓以栽培品為主，其種源主要來自野生混雜群體，種質資源缺乏，難以保證品質[2]。又滇重樓種苗繁育技術難度較大，生長周期長[3]，培育高品質滇重樓已成為亟待解決的問題。宋九華等[4]對野生與栽培重樓藥材的重樓皂苷和無機元素含量進行比較分析，發(fā)現(xiàn)野生品鈣、鎂、鐵、錳、鋅、銅含量高于栽培品，而栽培品的重樓皂苷Ⅰ含量高于野生品。鄒亮等[5]對6 個不同產(chǎn)地的野生與栽培滇重樓進行品質分析，發(fā)現(xiàn)野生品的重樓皂苷含量低于栽培品。李海濤等[6]對來自不同產(chǎn)地的野生與栽培滇重樓進行研究，發(fā)現(xiàn)栽培環(huán)境接近野生環(huán)境的栽培品皂苷含量較高。迄今尚未見不同自然分布區(qū)、引種馴化（野生變家種的移栽品）種植基地滇重樓品質差異的系統(tǒng)研究，是滇重樓入藥品質研究的薄弱環(huán)節(jié)。

中藥指紋圖譜基于對中藥物質群整體作用的認識，借助光譜和色譜等手段獲得藥物特征圖譜，可用于鑒別中藥真?zhèn)渭霸u價其質量一致性。中藥指紋圖譜可同時反映中藥中多種成分的含量情況，對全面控制其質量尤為重要。本研究收集22 份不同產(chǎn)地的野生與移栽滇重樓，建立滇重樓的HPLC 指紋圖譜，并對其進行化學模式識別研究，為全面控制滇重樓品質提供參考。

1 儀器與試藥

1100 LC 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）、ML204 型分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

重樓皂苷Ⅰ對照品（批號111590-201604，純度93.6%）、重樓皂苷Ⅱ對照品（批號111591-201604，純度91.4%）、重樓皂苷Ⅵ對照品（批號111592-201604，純度97.0%）、重樓皂苷Ⅶ對照品（批號111593-201604，純度94.0%），中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用。乙醇、石油醚、正丁醇均為分析純（成都科龍化學試劑），甲醇和乙腈為色譜純（德國默克），水為娃哈哈純凈水。

新鮮的野生及移栽滇重樓于2016 年7－8 月采集于貴州、云南、四川的典型分布區(qū)（見表1），經(jīng)大理大學藥學與化學學院生藥學教研室張德全副教授鑒定為百合科植物云南重樓P. polyphyllavar.yunnanensis，憑證植物標本及藥材標本均保存于三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室（重慶三峽學院）。根莖洗凈后45 ℃烘干至恒重，密封4 ℃貯存，用于品質分析。

表1 不同產(chǎn)地滇重樓樣品來源信息

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備

分別精密稱取重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ對照品各4 mg，加10 mL 甲醇溶解，制成0.4 mg/mL 的對照品貯備溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備

精密稱取樣品1.0 g，置圓底燒瓶，加入75%乙醇30 mL，回流提取2 次，第1 次回流提取1.5 h，第2 次回流提取1 h，合并提取液，減壓蒸干，加20 mL水溶解。用石油醚萃取5 次，每次20 mL，石油醚層棄去。再用正丁醇萃取3 次，每次20 mL。合并正丁醇層萃取液，減壓蒸干，用甲醇-乙腈（1∶1）溶解，定容至10 mL 容量瓶中，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱:Agela Venusil XBP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相:乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～11 min，80%～75%B；11～14 min，75%～72%B；14～24 min，72%～68%B；24～34 min，68%～62%B；34～43 min，62%～58%B；43～52 min，58%～54%B；52～58 min，54%～48%B；58～73 min，48%～36%B；73～83 min，36 %～29%B；83～93 min，29%～24%B；93～100 min，24 %～14 % B；100～120 min，14%B）；檢測波長:210 nm；柱溫:35 ℃；流速:1.0 mL/min；進樣量:10 μL。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗

按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件，將供試品溶液連續(xù)進樣6 次，結果11個共有峰的相對保留時間及相對峰面積RSD 均小于3%，表明該方法的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗取同一份供試品溶液（Y1），分別于0、2、4、8、12、24 h 進行HPLC 分析，結果11 個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD 均小于3%，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定。

2.4.3 重復性試驗按“2.2”項下方法制備6 份供試品溶液（Y1），進行HPLC 分析，結果11 個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD 均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜構建及共有峰確定

各樣品HPLC 指紋圖譜的測定參照周濃等[7]的方法并稍加改進。采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 版），以野生品Y1 的圖譜為參照，生成HPLC 共有模式圖譜（見圖1），并計算相似度（見表2）。可以看出，22 份樣品共有11 個共有峰，相似度為0.77～0.96，表明22 份滇重樓樣品成分基本相似。同時，野生品與移栽品具有良好的相似度，其值均為0.83，表明野生與移栽重樓整體成分類似，但成分含量存在一定差異。其中，峰6、峰8、峰10 分別為重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ和重樓皂苷Ⅰ。以峰10（重樓皂苷Ⅰ）為參考峰，11 個共有峰的相對保留時間和相對峰面積見表3、表4。相對保留時間RSD 為0.04%～2.29%，相對峰面積RSD 為64.91%～152.89%。相對峰面積RSD 較大，表明滇重樓藥材指紋圖譜中主要峰群的整體面貌基本一致，但成分含量有較大差異，進一步說明不同產(chǎn)地的滇重樓成分含量不同。

圖1 22 份滇重樓樣品HPLC 指紋圖譜疊加圖

表2 22 份滇重樓樣品指紋圖譜相似度（r）

表3 滇重樓樣品指紋圖譜共有峰的相對保留時間

表4 滇重樓樣品指紋圖譜共有峰的相對峰面積