牛奶中5-HMF的RP-HPLC測(cè)定方法優(yōu)化

趙悅 李林強(qiáng) 牛鵬飛

關(guān)鍵詞：牛奶;5-羥甲基糠醛（5-HMF）;反相高效液相色譜

中圖分類號(hào)：TS252文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）03-0798-03

Optimization of reverse-phase high-performance liquid chromatography（RP-HPLC） method for determination of 5-hydroxymethylfurfural in milk

ZHAO Yue，LI Lin-qiang，NIU Peng-fei

（College of Food Engineering and Nutritional Science， Shaanxi Normal University， Xian 710100， China）

Key words： milk;5-hydroxymethylfurfural（5-HMF）;reverse-phase high-performance liquid chromatography（RP-HPLC）

在人類生命的各個(gè)階段，乳制品均是飲食的重要組成部分，對(duì)骨骼和牙齒的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。牛奶中的營(yíng)養(yǎng)極為豐富[1]，但在熱處理過(guò)程中，因熱誘導(dǎo)而產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)可能會(huì)影響其品質(zhì)。美拉德反應(yīng)就是牛奶加熱過(guò)程中常見(jiàn)的一種化合反應(yīng)[2]。5-羥甲基糠醛（5-HMF）是含有碳水化合物的食物在熱處理期間發(fā)生美拉德反應(yīng)形成的Amadori化合物之一[3]。影響5-HMF在食品中生成的因素有碳水化合物含量、熱處理、水分活度、貯藏時(shí)間和包裝等[4-5]。目前的研究大多集中于將5-HMF作為篩選低乳糖牛奶褐變抑制劑的標(biāo)示物。Durling等[6]指出HMF是一種DNA損傷劑。5-HMF還可以代謝成5-磺基甲基糠醛（5-SMF），這是一種可以與DNA結(jié)合并引起誘變效應(yīng)的活性中間體。由此可見(jiàn)，5-HMF和5-SMF都是小鼠腸道的致癌物質(zhì)[7]。通常認(rèn)為，5-HMF對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有害[8]，它與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而導(dǎo)致體內(nèi)毒物的積累，并具有強(qiáng)大的生殖毒性[9]，同時(shí)也會(huì)損傷橫紋肌和內(nèi)臟[10]。許多國(guó)家已經(jīng)開(kāi)始嚴(yán)格限制蜂蜜、啤酒和葡萄糖注射液中5-HMF的質(zhì)量濃度[11]。檢測(cè)牛奶中5-HMF質(zhì)量濃度也十分重要。有學(xué)者開(kāi)發(fā)了一種比色法，用于測(cè)定乳制品中5-HMF的質(zhì)量濃度[12]。目前常用的5-HMF檢測(cè)方法有分光光度法[13]、毛細(xì)管電泳法[14]、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法[15]和高效液相色譜（HPLC）法[16]等，其中最為常用的是高效液相色譜法。雖然中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部對(duì)奶制品中5-HMF質(zhì)量濃度的HPLC檢測(cè)法（標(biāo)準(zhǔn)方法）[17]有所規(guī)定，但在試驗(yàn)過(guò)程中需添加較多的化學(xué)試劑，前處理步驟較為繁瑣，而且復(fù)雜的基質(zhì)也會(huì)造成目標(biāo)物與牛奶成分的共洗脫以及保留時(shí)間的變化，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，因此有必要從方法學(xué)上對(duì)其樣品前處理方法進(jìn)行優(yōu)化。5-HMF的HPLC檢測(cè)常用的樣品前處理方法有草酸法[18]、三氯乙酸法[19]、冰乙酸法[20]和乙腈法[21]等。本研究擬基于反相高效液相色譜（RP-HPLC）法建立一種可以對(duì)牛奶中5-HMF進(jìn)行定量分析的方法，以期為牛奶中5-HMF質(zhì)量濃度的檢測(cè)提供簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的方法。

1材料與方法

1.1材料

本研究所用液態(tài)牛奶購(gòu)于當(dāng)?shù)爻校兌葹?9%的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司，甲醇和乙腈（色譜純），購(gòu)自Fisher公司，三氯乙酸、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、草酸和冰乙酸均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器

本研究所用主要儀器有：U-3000型高效液相色譜系統(tǒng)（熱電公司產(chǎn)品）、DiamonsilTM型二代C18色譜分析柱（DIKMA有限公司產(chǎn)品）、SHZ-III型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品）、AL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品]、MX-F型旋渦混勻器（上海圣科儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品）、TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品）。

1.3方法

1.3.1RP-HPLC色譜條件色譜柱為DiamonsilTM型二代C18色譜分析柱，進(jìn)樣量10 μl，流速1 ml/mim，柱溫30 ℃，洗脫時(shí)間30 min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。流動(dòng)相A為5%甲醇+95%超純水，流動(dòng)相B為100%甲醇。洗脫梯度：流動(dòng)相A∶流動(dòng)相B=96∶4（體積比）。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的制備準(zhǔn)確稱取10 mg 5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品，加入甲醇溶解后，轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，用甲醇定容，混合均勻后配制成100 mg/L的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，并將其存儲(chǔ)在4 ℃冰箱中備用。

1.3.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立取5-HMF標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，將其配制成質(zhì)量濃度分別為0 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L和100 mg/L的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用外標(biāo)法，按1.3.1中的色譜條件進(jìn)樣分析。以峰面積為Y軸，以5-HMF的質(zhì)量濃度為X軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3精密度測(cè)試對(duì)質(zhì)量濃度為20 mg/L的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液分2批次進(jìn)樣，每批3針，共計(jì)6針。第一批進(jìn)樣結(jié)束后，標(biāo)準(zhǔn)溶液在4 ℃冰箱中放置過(guò)夜后再進(jìn)行第2批進(jìn)樣。統(tǒng)計(jì)6針進(jìn)樣的保留時(shí)間、峰高和峰面積，分別計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3.4牛奶前處理準(zhǔn)確量取197 ml牛奶置于燒杯中，加入3 ml 100 mg/L 5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成5-HMF質(zhì)量濃度為1.5 μg/ml的牛奶。用三氯乙酸法、冰乙酸法、乙腈法和標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行牛奶前處理，每種方法重復(fù)3次。

1.3.4.1三氯乙酸法取10 ml牛奶樣品置于25 ml試管中，加入1 ml 50%三氯乙酸溶液，旋渦1 min混勻，靜置10 min，轉(zhuǎn)移至離心管，6 000 r/min離心10 min。取上清液，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，按方法1.3.1中的色譜條件進(jìn)樣分析。

1.3.4.2冰乙酸法取10 ml牛奶樣品置于25 ml試管中，加入1 ml冰乙酸后，旋渦1 min混勻，靜置10 min，轉(zhuǎn)移至離心管，6 000 r/min離心10 min。取上清液，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，按方法1.3.1中的色譜條件進(jìn)樣分析。

1.3.4.3乙腈法取10 ml牛奶樣品置于燒杯中，加入20 ml乙腈，劇烈振蕩20 min，取上清液，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，按方法1.3.1中的色譜條件進(jìn)樣分析。

1.3.4.4標(biāo)準(zhǔn)方法取10 ml牛奶樣品置于25 ml試管中，加入5 ml 0.15 mol/L草酸，旋渦混勻，轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶中，用約10 ml甲醇分次淋洗試管，使樣品完全轉(zhuǎn)移。然后加入3 ml 92 g/L亞鐵氰化鉀溶液、3 ml 183 g/L乙酸鋅溶液，劇烈振蕩后靜置15 min，加甲醇定容至50 ml，旋渦1 min混勻，靜置10 min，轉(zhuǎn)移至離心管，6 000 r/min離心10 min。取上清液，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，按方法1.3.1中的色譜條件進(jìn)樣分析。

1.3.5加標(biāo)回收率準(zhǔn)確量取10 ml牛奶置于25 ml試管中，分別添加0.10 mg、0.20 mg和0.40 mg 5-HMF（每個(gè)水平重復(fù)6次），按方法1.3.4.1中的方法處理樣品，按方法1.3.1中的色譜條件進(jìn)樣分析，以衡量不同水平下目標(biāo)組分的加標(biāo)回收率。

1.3.6靈敏度以3倍信噪比測(cè)試5-HMF的檢出限（LOD），以10倍信噪比測(cè)試5-HMF的定量限（LOQ）。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行RP-HPLC測(cè)定，結(jié)果表明，5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液在280 nm處有響應(yīng)，分離效果明顯。以峰面積為Y軸，5-HMF的質(zhì)量濃度為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。5-HMF質(zhì)量濃度為0～100 mg/L時(shí)，線性關(guān)系良好（R2=0.998）。回歸方程：Y=1.312x+0.083。可以看出，5-HMF質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。因此，采用峰面積定量法對(duì)5-HMF進(jìn)行定量分析是可行的。

2.2精密度

按照方法1.3.1中的方法對(duì)質(zhì)量濃度為20 mg/L的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄保留時(shí)間、峰高和峰面積數(shù)據(jù)。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可知，保留時(shí)間、峰高和峰面積的RSD均小于2%。因此，RP-HPLC法對(duì)5-HMF的檢測(cè)結(jié)果符合要求，U-3000型高效液相色譜系統(tǒng)的精密度良好，適用于定量分析。

2.3牛奶前處理方法的優(yōu)化

采用4種不同的樣品前處理方法對(duì)牛奶進(jìn)行前處理，其中三氯乙酸法、冰乙酸法和標(biāo)準(zhǔn)方法均是通過(guò)加酸改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，使蛋白質(zhì)變性沉淀，再離心除去沉淀，取上清液用于5-HMF質(zhì)量濃度的檢測(cè)。乙腈法是通過(guò)有機(jī)溶劑破壞蛋白質(zhì)自身的氫鍵從而使蛋白質(zhì)變性沉淀，再對(duì)5-HMF的質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測(cè)。

除乙腈法外，其他3種方法分離出的目標(biāo)峰均能與干擾峰達(dá)到基線分離。三氯乙酸法處理后，樣品的色譜峰較理想。牛奶通過(guò)不同前處理后檢測(cè)到的5-HMF質(zhì)量濃度由高到低為：三氯乙酸法>乙腈法>冰乙酸法>標(biāo)準(zhǔn)方法，其中標(biāo)準(zhǔn)方法的RSD為5%，其他3種方法的RSD均小于4%。三氯乙酸法處理的樣品中檢測(cè)到的5-HMF質(zhì)量濃度最高，標(biāo)準(zhǔn)方法處理的樣品中檢測(cè)到的5-HMF質(zhì)量濃度最低，分別為1.36 μg/ml和0.57 μg/ml。三氯乙酸法、冰乙酸法、乙腈法、標(biāo)準(zhǔn)方法處理1個(gè)樣品所需的時(shí)間分別為25 min、25 min、30 min和45 min，三氯乙酸法和冰乙酸法用時(shí)最短，標(biāo)準(zhǔn)方法用時(shí)最長(zhǎng)。在試劑用量上，三氯乙酸法和冰乙酸法的試劑用量最少，只需1 ml，標(biāo)準(zhǔn)方法試劑用量最大，需要40 ml。總之，三氯乙酸法相較與標(biāo)準(zhǔn)方法更加快速、準(zhǔn)確，并且試劑用量少，因此采用三氯乙酸法對(duì)樣品進(jìn)行前處理。

2.4加標(biāo)回收率

按方法1.3.5中的方法進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)試。在10 ml牛奶中添加5-HMF后，樣品中的目標(biāo)峰明顯增大。隨著5-HMF添加量的增加，其加標(biāo)回收率增加，添加0.10 mg、0.20 mg和0.40 mg 5-HMF的加標(biāo)回收率分別為85.65%、93.34%和100.95%，其RSD分別為1.62%、1.31%和0.66%。說(shuō)明，RP-HPLC法的準(zhǔn)確性好，穩(wěn)定性高，可行性強(qiáng)，適合用于牛奶中5-HMF的定量分析。

2.5靈敏度

按方法1.3.6中的方法進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，結(jié)果表明，RP-HPLC法測(cè)定牛奶中5-HMF的LOD為0.037 5 mg/L，LOQ為0.069 5 mg/L。

3結(jié)論

牛奶在加工處理過(guò)程中容易發(fā)生美拉德反應(yīng)從而產(chǎn)生5-HMF，5-HMF具有一定毒性，因此建立一種可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)牛奶中5-HMF的方法至關(guān)重要。本試驗(yàn)采用RP-HPLC法對(duì)牛奶中5-HMF的質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定，并在前人研究的基礎(chǔ)上對(duì)牛奶前處理的方法進(jìn)行了優(yōu)化。其中，三氯乙酸法處理后樣品的目標(biāo)峰出峰明顯，峰型理想，檢測(cè)到的5-HMF質(zhì)量濃度最高，并且樣品前處理時(shí)間最短，試劑用量最少。采用三氯乙酸法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，然后用RP-HPLC法定量檢測(cè)牛奶中5-HMF的質(zhì)量濃度，不僅避免了其他方法因試驗(yàn)步驟復(fù)雜導(dǎo)致的結(jié)果不穩(wěn)定等問(wèn)題，還有效縮短了樣品處理時(shí)間，減少了試劑用量，對(duì)奶源的質(zhì)量控制起到很好的監(jiān)控作用。

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（責(zé)任編輯：王妮）