響應面法優化地骨皮總生物堿微波提取工藝研究

李新蕊，司明東，謝振元，溫子帥，馬東來，鄭玉光

(河北中醫學院 藥學院，河北 石家莊 050200)

地骨皮為茄科植物枸杞(LyciumchinenseMill.)或寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)的干燥根皮，地骨皮入藥始載于《神農本草經》，春初或秋后采挖根部，洗凈，剝取根皮，曬干。味甘，性寒，歸肺、肝、腎經。具有涼血除蒸、清肺降火之功效[1]?，F代研究表明地骨皮中含有多種化學成分，主要包括生物堿類、有機酸及其酯類、蒽醌類等，現代藥理研究表明地骨皮具有解熱鎮痛、降血糖、降血壓、降血脂、抗菌以及免疫調節等藥理作用[2]。

從地骨皮中分離得到的生物堿類化合物對糖尿病、高血壓等疾病有明顯的抑制作用[3]，其中地骨皮甲素具有抑制糖尿病相關的淀粉樣蛋白聚集作用[4]，地骨皮乙素可通過其與脂多糖結合抑制脂多糖誘導的感染性小鼠肝臟炎癥反應[5]；甜菜堿具有降低TGF-β1和TNF-α水平的作用，從而在糖尿病腎病微血管炎癥過程中起到延緩或抑制作用[6]。

響應面法(Response surface methodology)具有簡便、預測結果精準等優點，目前廣泛應用于化工、農業、制藥等多個領域，是一種以統計學原理為基礎，用于實驗設計與優化的分析方法，通過建立體系的響應值與多個因素間的函數關系，評價各因素間的交互作用，更好地確定實驗的最優條件[7-8]。本實驗采用微波法提取地骨皮中總生物堿，利用紫外分光光度計測定地骨皮中總生物堿含量，通過Box-Benhnken設計-響應面法優化其提取工藝條件，為地骨皮中總生物堿資源綜合開發利用提供參考。

1 儀器、試劑與藥材

UV-2600型紫外可見分光光度計(日本島津儀器有限公司)，Biotage Initiator+微波合成儀(Biotage Sweden AB)，鹽酸小檗堿標準品(LOT：Y31J9H67024)購自上海源葉生物有限公司，冰乙酸、溴百里香酚藍、三氯甲烷均購自天津市百世化工有限公司。

30批地骨皮藥材分別購自河北安國、安徽亳州、成都荷花池藥材市場，具體產地見表1。

2 方法與結果

2.1 標準曲線的繪制

精密稱取鹽酸小檗堿2.5 mg，用甲醇定容到25 mL的容量瓶中，分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于分液漏斗中，加入pH=4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液10 mL、0.3%溴百里香芬蘭溶液6 mL、氯仿20 mL，混勻，靜置10 min后，分出氯仿層，加少許無水硫酸鈉干燥，濾液定容于50 mL容量瓶中，于417 nm處測定吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標、鹽酸小檗堿標準溶液的濃度X(mg/mL)為橫坐標，進行線性回歸，擬合得回歸方程Y=37.249X-0.241 1，相關系數r值為0.996 5。

表1 地骨皮產地信息

2.2 供試品的制備

取0.5 g地骨皮S1樣品加入12.5 mL的60%乙醇放于反應釜中，溫度70 ℃，微波提取30 min，過濾，取3 mL濾液置于分液漏斗中，按“2.1”項下方法處理，在417 nm處測定吸光度。

2.3 方法學考察

在精密度試驗中，精密量取同一濃度對照品溶液適量，于417 nm處測定吸光度，連續測定6次，RSD為0.02%，表明儀器精密度良好；在穩定性試驗中，精密稱取S1號樣品0.5 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液6份，分別于室溫下放置10、20、30、40、50、60 min后于417 nm處測定吸光度，結果RSD值為1.82%，結果表明供試品溶液60 min內穩定性良好；在重復性試驗中，精密稱取S1號樣品0.5 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，于417 nm處測定吸光度，結果RSD值為2.27%，說明該方法重復性良好；在加樣回收率試驗中，精密稱取已知總生物堿含量的S1號樣品0.5 g，共6份，均加入適量標準品溶液，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，于417 nm處測定吸光度，結果RSD值為2.78%，說明該方法準確性良好。

2.4 Box-Benhnken設計-響應面法優化地骨皮總生物堿的微波提取工藝

2.4.1 試驗設計 根據前期基礎實驗研究，選取液料比(A)、乙醇濃度(B)、微波溫度(C)、微波提取時間(D)為自變量，總生物堿提取率作為響應值，采用Box-Benhnken-設計方案，在4因素3水平的基礎上，運用響應面法優化地骨皮中總生物堿的最佳提取工藝，因素與水平見表2，試驗設計與結果見表3。

表2 設計因素編碼與水平

表3 響應面試驗設計與結果

2.4.2 模型建立與方差分析 利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件進行結果統計并分析處理結果如表3所示。對表3數據進行多元二次回歸擬合，建立提取工藝參數回歸模型，擬合回歸方程為Y= 3.41 + 0.76A+0.25B+0.050C+0.27D+0.19AC-0.46CD- 0.64A2- 0.15B2- 0.36C2- 0.26D2。

表4 回歸方程的方差分析

2.4.3 響應面分析 利用 Design-Expert 8.0.6 Trial軟件分析，得出影響地骨皮中總生物堿提取率的各因素交互作用的相應響應面圖，各因素對地骨皮中總生物堿提取率的影響見圖1。從圖1三維立體圖中可以看出，a、b、c的曲面均陡峭，提示乙醇濃度與液料比之間、微波溫度與液料比之間、微波時間與液料比之間交互作用均達到顯著水平；d、e的曲面均不陡峭，提示微波溫度與乙醇濃度之間、微波時間與乙醇濃度之間交互作用均未達到顯著水平，但均存在極大值點[9]；圖1f曲面較陡峭，提示微波時間和微波溫度交互作用對地骨皮總生物堿提取率顯著，這與方差分析結果基本一致。

由Design-Expert 8.0.6 Trial軟件分析得出地骨皮總生物堿最大提取率為3.86%，最佳條件為液料比27.26∶1(mL∶g)、乙醇濃度70%、微波提取溫度72.62 ℃、微波提取時間22.23 min。以實際操作的方便考慮，將其修正為液料比27∶1(mL∶g)、乙醇濃度70%、微波提取溫度73℃、微波提取時間22 min。

2.4.4 驗證試驗 根據優化的最佳工藝條件，取地骨皮S1樣品0.5 g進行3次平行試驗，結果，總生物堿的平均提取率為3.81%，RSD為1.9%，與預測值3.86%的相對誤差為1.30%，說明該工藝穩定可靠。

圖1 各因素交互作用對總生物堿提取率之間的響應面

3 不同批次的地骨皮總生物堿含量

按“2.2”項下方法制備樣品待測溶液，每個樣品平行三次試驗。結果見表6。

表6 30批次地骨皮中總生物堿的含量

4 討論

地骨皮中化學成分復雜，且有效成分提取分離難度大，生物堿類是其次生代謝產物中較大的一類，不同批次地骨皮總生物堿含量在14.68～39.20 mg/g之間，總生物堿的提取含量影響著地骨皮的質量[10-11]。S17號河南產地骨皮總生物堿含量最高為39.20 mg/g，除甘肅外同一產地地骨皮總生物堿含量相差不大，安徽在25.87～32.71 mg/g之間、河南在26.18～39.20 mg/g之間、河北在24.52～30.97 mg/g之間，甘肅在14.68～35.50 mg/g之間。安徽、河南、河北所產地骨皮質量穩定，甘肅所產質量差異較大，因在市場所購藥材，生長年限存放時間不能保持一致，可能會對含量有影響，本課題組后續將對其進行研究。

筆者在前期試驗的基礎上，通過Box-Benhnken設計-響應面法成功優化了地骨皮中總生物堿的提取工藝，最優條件為液料比27∶1(mL∶g)、乙醇濃度70%、微波提取溫度73 ℃、微波提取時間22 min，且優化后的提取工藝合理可行，可為地骨皮中總生物堿的開發與利用提供參考。