調督針刺對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力的改善作用*

孫興華，張 淼，武文鵬，李書霖

（黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是癡呆最常見的一種形式，又稱為老年性癡呆（senile dementia）[1-2]，常隱襲起病，主要表現為持續進行性的智能衰退無緩解，早期以近期記憶力受損為主，中期以視空間技能損害、定向力障礙、失語、失用、失認以及人格改變為主，晚期可出現判斷力、認知力的完全喪失[3-4]。AD已成為嚴重威脅人們健康的主要疾病之一[5-6]，是神經科學領域尚未解決的難題。中醫藥治療AD在理論和臨床上都積累了豐富經驗[7-9]，如《醫林改錯·腦髓篇》載：“高年無記性者，腦髓漸空?！薄妒颐劁洝吩弧爸未魺o奇法，治痰即治呆也。”黑龍江中醫藥大學高維濱教授基于“督脈貫脊屬腎入絡腦”的認識，臨證診療時常通過調整督脈而疏通經絡、調和氣血、充髓益智、醒腦調神。高維濱教授的督脈理論針灸學術思想被應用于臨床[10]。課題組前期臨床觀察發現，調督針刺能夠改善AD患者的認知功能，延緩病情進展，提高患者的生存質量。但有關針刺治療AD作用機制的研究報道較少。已有研究表明，炎性反應參與AD的病理過程，其發生與β-淀粉樣蛋白（amyloid beta-protein，Aβ）淀粉樣斑塊沉積與長期炎癥反應造成腦損傷相關，Aβ過度激活周圍的星形膠質，促進白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、補體等多種炎癥因子的產生，進而引起炎癥反應，使神經元損傷而影響認知功能[11-12]。因此，本實驗通過雙側海馬注射Aβ1-42制備AD大鼠模型，觀察調督針刺對AD大鼠學習記憶能力的改善作用以及對海馬病理組織形態學、IL-6、TNF-α、GFAP的影響，為臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠48只，雄性，2～3月齡，體質量（250±20）g，購于黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（黑）2016004。實驗過程中對動物所進行的操作嚴格按照《關于善待實驗動物的指導下意見》標準進行。

1.2 儀器及試劑 大鼠腦立體定位儀（成都泰盟科技有限公司）；Morris水迷宮（安徽淮北正華生物儀器設備有限公司）；LKB-V型超薄切片機（瑞士BROMMA公司）；Motic Med 6.0病理圖像分析系統（美國Motic）；淀粉樣β蛋白片段1-42（Sigma公司）；抗IL-6多克隆抗體、抗TNF-α多克隆抗體、抗GFAP多克隆抗體均購自美國NeoMarkers公司；S-P試劑盒、DAB顯色液（北京中杉金橋生物有限公司）；蘇木素液、醋酸雙氧鈾、俄酸、伊紅染色液、戊二醛由黑龍江中醫藥大學解剖教研室提供。

1.3 實驗動物分組 實驗前分籠適應性飼養1周。適應性飼養1周的后2 d進行水迷宮訓練，每天2次。經過訓練，將反應特別敏感或過于遲鈍的大鼠剔除，保留48只大鼠用于實驗。采用隨機數字表法隨機分為空白組、假手術組、模型組、針刺組，每組12只。

1.4 模型制備 參照文獻 [13-14]所述的方法制備AD模型，采用10%水合氯醛腹腔注射進行麻醉，將大鼠固定腦立體定位儀上，剪去頭頂部鼠毛，常規消毒，切開皮膚，選取雙側海馬區作為注射Aβ1-42靶區，于前囟向后3.0 mm，中線分別向左右旁開1.5 mm，將顱骨鉆開，暴露硬腦膜，采用氧化氫法剔除硬腦膜，鉆孔后采用微量進樣器將Aβ1-425 μL均勻緩慢注入，5 min后撤針，以確保Aβ1-42溶液擴散完全。撤針后，縫合切口，常規飼養，予以青霉素腹腔注射預防術后感染。

1.5 各組處理方法 空白組：正常飼養，不進行任何處理。假手術組：顱內注射等量生理鹽水（5 μL），其他處理同模型組。模型組：造模成功后第8天開始，給予同等針刺組相同抓取、固定。針刺組：造模成功后第8天開始，參照“大鼠穴位圖譜”[15]取大鼠“百會”“風府”。用0.35 mm×15 mm不銹鋼毫針針刺“百會”（以15°角向前平刺 2 mm）、“風府”（直刺 2 mm），補瀉手法采用平補平瀉，捻轉1 min，接通脈沖針灸治療儀（KWD-808I型），疏波（頻率為2 Hz），強度以大鼠局部輕顫為度，留針30 min，每天1次，連續治療28 d。

1.6 觀察指標及方法

1.6.1 行為學檢測大鼠空間學習與記憶能力 采用Morris水迷宮法。本實驗造模前連續訓練4次，治療第23天后開始連續訓練4 d，每天訓練4次。將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠從水中到找到平臺所需的時間（即潛伏期）。造模前和治療后定位航行，試驗結束后第2天進行空間搜索試驗。去除平臺，記錄在60 s內大鼠找到平臺游泳距離。

1.6.2 光鏡技術檢測海馬組織病理形態學 大鼠10%水合氯醛麻醉，50 mL生理鹽水灌注左心室，待肝臟變白后，4%多聚甲醛灌注，斷頭取腦組織，在冰盒上迅速剝離海馬組織。海馬組織固定，常規方法制備石蠟切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.6.3 免疫組織化學法檢測IL-6、TNF-α、GFAP的表達 取上述石蠟包埋的各組大鼠腦組織，常規脫蠟至水，修復抗原后，按照北京中杉金橋生物有限公司提供的免疫組化試劑盒操作步驟說明進行檢測具體操作。采用Motic Med 6.0病理圖像分析系統進行半定量分析，以細胞質染為黃色或黃棕色為陽性細胞，每張片中選取5個染色較好的視野拍照，計算陽性細胞染色的積分光密度（以IOD值表示），IOD=陽性面積×平均光密度，取5個高倍視野的均值代表該樣本陽性細胞的相對表達量。每組分析4例。

1.7 統計學分析 采用SPSS 18.0統計軟件包進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（±s）的形式表示；組間比較采用單因素方差分析，方差齊時用LSD法，方差不齊時用Tamhane’s T2檢驗，檢驗水準α=0.05。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況 本實驗造模后，模型組大鼠逐漸出現精神欠佳、食量減少、行動減緩、反應遲鈍，體重增長緩慢。針刺組大鼠造模后1周內的一般情況表現同模型組，但隨著針刺治療時間的推移而出現精神狀態改善、進食增加、活動增多的表現。

2.2 各組大鼠治療前后的體質量變化 造模前，各組大鼠體質量比較，差異無統計學意義。治療后，與假手術組比較，模型組大鼠體質量增長緩慢，差異具有統計學意義（P<0.05）；與模型組比較，針刺組大鼠體質量增長較快，差異具有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠治療前后的體質量變化（±s，n=12，g）

表1 各組大鼠治療前后的體質量變化（±s，n=12，g）

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別 造模前 治療后空白組 2 6 4.2 0±1 8.4 7 3 8 4.7 0±3 2.6 1假手術組 2 6 1.5 0±2 1.2 2 3 7 7.9 0±3 4.8 5模型組 2 6 2.7 0±1 9.6 4 3 2 5.5 0±3 1.2 3*針刺組 2 6 6.4 0±2 0.8 3 3 5 8.2 0±2 6.4 4#

2.3 針刺對AD大鼠潛伏期和游泳距離的影響與空白組比較，假手術組潛伏期和游泳距離均無統計學差異；與假手術組比較，模型組潛伏期明顯延長（P<0.05），游泳距離明顯增加（P<0.05）；與模型組比較，針刺組大鼠潛伏期明顯縮短（P<0.05），游泳距離明顯縮短（P<0.05），見表 2。

表2 針刺對AD大鼠潛伏期和游泳距離的影響（±s，n=12）

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別 潛伏期/s 游泳距離/c m空白組 1 6.9 3±3.5 1 5 7 4.3 6±6 2.4 3假手術組 1 8.5 6±4.3 0 5 9 0.7 5±7 4.5 7模型組 4 2.7 2±7.4 6* 1 2 0 9.2 6±1 0 7.6 2*針刺組 3 1.4 5±5.2 3# 8 7 6.5 2±8 5.1 6#

2.4 針刺對AD大鼠海馬組織病理形態學的影響HE染色可看出，空白組神經元分布均勻，形態規整，核仁清晰。假手術組神經元形態尚規整，核仁清晰，散見少量炎性細胞和凋亡小體。模型組神經細胞排列紊亂，細胞質較少，核仁不清晰，神經元萎縮，毛細血管腫脹。與模型組相比，針刺組神經細胞排列較為規則，神經元萎縮較少，見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織病理圖（HE染色，×400）

2.5 針刺對AD大鼠海馬組織IL-6、TNF-α、GFAP表達的影響 免疫組化結果示，IL-6、TNF-α、GFAP陽性細胞胞漿呈棕黃色，各組海馬組織均有IL-6、TNF-α、GFAP表達。模型組表達強，表達細胞多；空白組和假手術組表達弱，表達細胞少；針刺組表達介于模型組和空白組/假手術組之間。與假手術組比較，模型組大鼠IL-6、TNF-α、GFAP的表達顯著增加（P<0.05）；與模型組比較，針刺組大鼠IL-6、TNF-α、GFAP的表達明顯減弱（P<0.05）。結果見圖 2、表 3。

圖2 各組大鼠海馬組織IL-6、TNF-α、GFAP免疫組化結果（×400）

表3 各組大鼠海馬組織IL-6、TNF-α、GFAP表達比較（±s，n=4）

表3 各組大鼠海馬組織IL-6、TNF-α、GFAP表達比較（±s，n=4）

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別 I L-6 T N F-α G F A P空白組 0.1 8 9±0.0 3 2 0.2 3 5±0.0 2 8 0.2 7 0±0.0 4 1假手術組 0.2 1 0±0.0 2 6 0.2 5 4±0.0 3 7 0.3 1 1±0.0 3 4模型組 0.7 8 4±0.0 5 3* 0.9 7 2±0.0 8 9* 0.8 6 5±0.0 9 5*針刺組 0.5 2 1±0.0 3 8# 0.7 6 3±0.0 6 2# 0.5 9 4±0.0 5 6#

3 討論

阿爾茨海默病是癡呆最常見的原因，其發病率呈隨年齡增長而逐漸增加的趨勢[16]，嚴重影響老年人社交與生活，給患者及家庭、社會帶來沉重的負擔，對社會經濟發展和老年衛生保健帶來巨大挑戰[17]。如何逆轉或阻止AD的病情進展是世界性的難題。因此，探索AD的致病原因及形成機制，以及探討AD的消除策略和手段對于防治AD、提高人們生存質量具有重要的醫學價值，也是腦科學應用基礎研究的重要前沿。

構建一個好的AD動物模型，使其更貼切于人類AD發病機制是實驗成功的保障。目前用于構建AD的動物模型有多種方式，如根據微量元素學說建立的阿爾茨海默病模型，以膽堿能損傷學說建立的阿爾茨海默病模型，以衰老學說建立的阿爾茨海默病模型，以Aβ為基礎建立的阿爾茨海默病模型，采用轉基因技術建立的阿爾茨海默病模型等[18]，不同的制備方法各有側重。目前，認為Aβ沉積是阿爾茨海默病發病的中心環節，大腦海馬區是內側顳葉系統中與學習記憶最為密切相關的結構。因此，海馬區是研究AD的理想靶區。本次研究即采用雙側海馬注射Aβ1-42制備AD大鼠模型，從行為學結果看，與假手術組比較，模型組大鼠潛伏期和游泳距離顯著增加，說明模型組大鼠學習、記憶能力減退，證明所構建的模型是成功的，可以用于后續研究。

學習記憶是大腦的高級功能，學習是記憶的神經基礎，記憶障礙及/或理解、分析、判斷等學習能力的障礙，是AD的早發癥狀之一。學習記憶水平是AD的診斷和療效評價指標中最重要的因素。改善AD患者的記憶能力一直是神經科學的研究熱點之一。對學習記憶的評價是AD動物模型的必要檢測指標之一。Morris水迷宮已被廣泛應用于神經生物學等領域的基礎和應用研究中，得到了學者們的廣泛認可。因此，Morris水迷宮實驗用來評價AD動物模型的行為學是恰當的。本次研究結果發現，與模型組比較，針刺組大鼠潛伏期和游泳距離均顯著縮短，說明針刺能夠改善AD大鼠的學習、記憶能力。

AD病因及機制迄今尚未完全闡明[19]。學者們認為可能與遺傳學、免疫功能紊亂、炎癥學說、神經遞質障礙、細胞骨架改變等有關[20-21]。阿爾茨海默病的主要病理特征是老年斑、神經元纖維纏結、神經元大量丟失。而老年斑的核心成分為Aβ，Aβ大量沉積可引起炎癥反應[22-24]。AD的炎癥假說越來越引起重視。研究認為，中樞神經炎癥及外周炎癥反應均參與AD的病理過程。炎癥反應既可能是AD病理的一個結果，又會進一步加劇AD中的Aβ沉積。有證據表明，小膠質細胞介導的炎癥反應是AD患者腦中的顯著病理特點[25]。AD發生發展過程中星形膠質細胞、小膠質細胞能夠產生包括 IL-1、IL-6、TNF-α、NO、GFAP 在內的多種致炎因子，這些致炎因子的過度表達能夠損害神經元，同時還能夠刺激膠質增生反應，使神經元的退行性變進一步加劇。因此，IL-6、TNF-α、GFAP炎性因子水平升高在AD的發生、發展過程中起著重要作用。本次研究觀察針刺治療前后AD大鼠海馬組織IL-6、TNF-α、GFAP表達發現，與模型組比較，針刺組IL-6、TNF-α、GFAP表達明顯降低，提示針刺具有調節AD大鼠炎癥反應的作用。

綜上所述，本次研究證實調督針刺具有改善AD模型大鼠學習、記憶能力的作用，其作用機制可能是通過降低炎癥反應實現的。