中國蜂膠及其主要組分對兩種肺癌細胞作用及機制研究

孔令米 劉會 李俊雅 玄紅專

（聊城大學生命科學學院，聊城 252059）

蜂膠是蜜蜂從植物嫩芽和枝條的表面或傷口處采集的樹脂，再混合蜂蠟、花粉及自身分泌物質等形成的一種具有樹脂芳香味的天然活性物質。蜂膠中富含多種黃酮類、萜烯類和酚酸類等具有藥理活性的天然成分[1-3]，這些生物活性成分賦予蜂膠多種藥理學功能，例如抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗炎癥、免疫調節[4-6]等。

肺癌是全球發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，對全球人類健康造成嚴重威脅。盡管當前臨床治療方式多種多樣，但是肺癌的存活率仍然很低，多數病人死于遠端轉移，對人類健康危害極大[7]。蜂膠作為一種天然活性產物在抗腫瘤方面具有突出功效，且無明顯毒副作用。研究發現中國蜂膠中的黃酮類和酯類化合物具有明顯抗腫瘤功效[8]，具有非常好的應用價值。

本研究利用中國蜂膠及其主要組分（咖啡酸苯乙酯、白楊素、芹菜素、高良姜素）對兩種肺癌細胞A549和H1299的抗癌作用及機制進行了分析，為蜂膠的抗腫瘤活性研究提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中國蜂膠產自山東省，主要膠源植物為楊樹。主要試劑包括：RPMI-1640培養基（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；胰酶、磺酰羅丹明B（SRB）（sigma公司）；Hoechst 33258、活性氧檢測熒光探針2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）和線粒體膜電位熒光探針JC-1（美國Sigma公司）；抗體Caspase-3、PARP（美國Cell Signaling Technology）、β-actin（美國Santa Cruz Biotechnology）；其他試劑均為分析純。

A549、H1299細胞由本試驗所在實驗室保存。

1.2 試驗儀器

Heal Force生物安全柜、Heal Force CO2培養箱（力康生物醫療科技控股有限公司）；TE2000S 倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus）；電泳儀和電轉儀（Bio-Rad公司）；MK3酶標儀（芬蘭雷勃公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 蜂膠乙醇提取物（EECP）的制備

中國蜂膠來自山東省，主要膠源植物為楊樹。中國蜂膠經冷凍、粉碎、95%（v/v）酒精浸提24h，減壓過濾，濾液經40℃旋轉蒸發濃縮至恒重，放入-20℃冰箱中保存，使用時用95%酒精溶解。蜂膠中主要組分咖啡酸苯乙酯（CAPE）、白楊素、芹菜素、高良姜素均從蜂膠水提物中分離提純，并經紫外光譜（UV）和核磁共振（NMR）鑒定，純度為98%以上[9]。

1.3.2 細胞培養

肺癌A549和H1299細胞均培養在添加10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，孵育條件為：5% CO2、37℃、飽和濕度CO2培養箱中。倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態。

1.3.3 細胞存活率的測定

將處于對數生長期的細胞按4000個/孔種植到96孔板，待腫瘤細胞長到60%以上，除正常組外，處理組細胞分別經EECP（100μg/ml）及咖啡酸苯乙酯、白楊素、芹菜素、高良姜素（80μM）分別處理48h后，棄細胞培養液，用10%三氯乙酸4℃固定1h，然后用SRB染色10min，晾干，100mmol/l Tris堿溶解，在492nm處測吸光值。

細胞存活率（%）=（處理組OD值/對照組OD值）×100%

1.3.4 Hoechst33258染色

將處于對數生長期的A549和H1299細胞按4×104個/孔種植到24孔板中。待腫瘤細胞長到60%以上，除正常組外，處理組細胞分別經EECP（100μg/ml）及咖啡酸苯乙酯、白楊素、芹菜素、高良姜素（80μM）分別處理24h。棄細胞培養液，用1×PBS輕輕潤洗1次，加入Hoechst 33258工作液500μl，于CO2培養箱中孵育30min。棄染色液，用1×PBS輕輕潤洗2次，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5 Transwell小室體外侵襲實驗

取對數生長期的A549和H1299細胞，消化，調整細胞密度到5×105/ml，transwell上室加入200μl細胞懸液，下室中加入600μl含20%胎牛血清的RPMI-1640培養液，37℃孵育24h。用濕棉簽擦掉上室上面的Matrigel和非侵襲細胞，上室下面用0.1%結晶紫固定染色30min，高倍鏡下計數穿過微孔膜的細胞數。直徑上取4個視野，求其平均值。

1.3.6 活性氧（ROS）水平的檢測

將處于對數生長期的A549和H1299細胞按4×104個/ml種植到共聚焦小皿中。待細胞長到60%以上，除正常組外，處理組細胞分別經EECP（100μg/ml）及咖啡酸苯乙酯、白楊素、芹菜素、高良姜素（80μM）分別處理24h。棄細胞培養液，用1×PBS清洗1次，加DCFH-DA應用液1ml，37℃孵育30min。棄DCFH-DA應用液，用1×PBS漂洗3次，每次5min，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.7 線粒體膜電位檢測

將處于對數生長期的A549和H1299細胞按4×104個/ml種植到共聚焦小皿中。待腫瘤細胞長到60%以上，除正常組外，處理組細胞分別經EECP（100μg/ml）及咖啡酸苯乙酯、白楊素、芹菜素、高良姜素（80μM）分別處理24h。棄細胞培養液，用1×PBS清洗，加JC-1染色液500μl，37℃孵育20min。棄JC-1染色液，用1×PBS漂洗3次，每次5min，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.8 細胞蛋白提取及蛋白質免疫印跡（Western Blotting）

EECP（100μg/ml）及咖啡酸苯乙酯、白楊素、芹菜素、高良姜素（80μM）分別處理24h后收集各組細胞，在RIPA裂解液中冰上裂解30min，用BCA法測定總蛋白濃度。取30~40μg總蛋白提取物上樣，經12% SDS-PAGE凝膠電泳后，轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫下封閉1h，然后加入caspase 3、PARP和β-actin一抗稀釋液（1∶1000）于4℃冰箱孵育過夜。用1×PBST洗膜3次，每次5min；再加入二抗，室溫孵育1h，1×PBST洗膜3次，每次5min采用ECL顯色。Quantity One進行蛋白定量分析。

1.4 數據統計

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計量資料用均數±標準差（±S）表示，用t檢驗進行統計學分析。P < 0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 中國蜂膠及其主要組分對H1299細胞存活率的影響

前期我們已經檢測了蜂膠及其主要組分對肺癌A549細胞存活率的影響[9]，蜂膠及其主要組分對H1299細胞存活率的影響如圖1-1、1-2和1-3所示。

由圖1可以看出，蜂膠及其主要組分CAPE、芹菜素、白楊素和高良姜素在24h和48h顯著抑制H1299細胞的增殖，且呈時間和劑量依賴性（*P<0.05，**P<0.01）。結合前期蜂膠及其主要組分對A549細胞的影響，可以看出蜂膠及其主要組分對兩種肺癌細胞均具有較好的抑制功效。

圖1-1 EECP在24h和48h對H1299細胞存活率的影響

圖1-2 蜂膠中主要組分在24h對H1299細胞存活率的影響

圖1-3 蜂膠中主要組分在48h對H1299細胞存活率的影響

2.2 中國蜂膠及其主要組分對A549和H1299細胞侵襲的影響

腫瘤細胞的侵襲和轉移是腫瘤治療中的難點。由圖2可以看出，EECP及蜂膠主要組分處理A549和H1299細胞24h后，顯著抑制兩種腫瘤細胞的侵襲，且咖啡酸苯乙酯、白楊素和芹菜素效果尤為顯著。

圖2 中國蜂膠及其主要組分對A549和H1299細胞侵襲的影響

2.3 中國蜂膠及其主要組分對A549和H1299細胞凋亡的影響

前期我們已經證明蜂膠及其主要組分能顯著抑制多種腫瘤細胞增殖[9]。經Hoechst33258染色可以看出，兩種肺癌細胞（A549和H1299）經EECP（100μg/ml）和咖啡酸苯乙酯、白楊素、芹菜素、高良姜素（80μM）分別處理24h后，細胞數量減少，細胞凋亡顯著上升，且細胞核出現顯著的核染色質濃縮和破裂現象（圖3）。

圖3 中國蜂膠及其主要組分對A549和H1299細胞凋亡的影響

2.4 中國蜂膠及其主要組分對A549和H1299細胞凋亡蛋白表達的影響

Caspase酶家族在凋亡信號傳導過程中發揮關鍵作用[10]。PARP剪切被認為是細胞凋亡的另一個重要指標，也通常被認為是Caspase-3激活的指標。EECP（100μg/ml）和咖啡酸苯乙酯、白楊素、芹菜素、高良姜素（80μM）對PARP和caspase 3的影響如圖4所示。在A549和H1299兩種細胞中，蜂膠及其主要組分顯著上調凋亡執行者caspase 3的水平，而未剪切的PARP水平顯著降低（*P<0.05，**P<0.01）。

圖4 中國蜂膠及其主要組分對A549和H1299細胞中PARP、Caspase 3蛋白表達的影響

2.5 中國蜂膠及其主要組分對A549和H1299細胞中ROS水平的影響

細胞內ROS過多積累，在細胞凋亡、分化和增殖中發揮重要作用[11]。由圖5可以看出，H1299細胞經中國蜂膠及其主要組分處理24h后，ROS水平顯著上調，但在A549細胞中，咖啡酸苯乙酯對ROS水平影響不顯著，其他幾種組分如白楊素、芹菜素和高良姜素及EECP顯著上調ROS的水平（*P<0.05，**P<0.01）。

圖5 中國蜂膠及其主要組分對A549和H1299細胞中ROS水平的影響

2.6 中國蜂膠及其主要組分對A549和H1299細胞內線粒體膜電位的影響

細胞內ROS過多積累會引起線粒體的損傷，導致線粒體膜電位的下降。線粒體膜電位的下降出現在細胞形態學改變之前，是凋亡的早期表現[12]。本研究采用線粒體膜電位熒光探針JC-1，通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化，結果如圖6所示。在H1299細胞中，EECP對線粒體膜電位影響較顯著，其他組分如白楊素和芹菜素對A549細胞中線粒體膜電位影響不顯著。在H1299細胞中蜂膠及其主要組分顯著降低線粒體膜電位水平（*P<0.05，**P<0.01）。

圖6 中國蜂膠及其主要組分對A549和H1299細胞內線粒體膜電位的影響

3 討論

肺癌是一種惡性腫瘤，嚴重危害人體健康。盡管肺癌治療手段不斷進步，總體生存率、生存期不斷延長，但肺癌治療成本仍較高。蜂膠是一種藥用價值較高的天然產物，具有較好的抗腫瘤功效，對多種腫瘤具有顯著的抑制功效。

肺癌轉移是肺癌的惡性標志和生物學特征，也是導致肺癌病人治療失敗和死亡的主要原因。本研究發現中國蜂膠乙醇提取物及其主要組分咖啡酸苯乙酯、白楊素、芹菜素和高良姜素顯著抑制兩種肺癌細胞A549和H1299的侵襲和浸潤，表明了蜂膠及其主要組分抑制肺癌轉移的潛在功效。此外，蜂膠及其主要組分顯著促進兩種肺癌細胞的凋亡，其促凋亡效果與蜂膠及其主要組分能夠活化促凋亡基因，促進細胞內活性氧的積聚，破壞線粒體膜電位進而誘導肺癌細胞凋亡有關。

蜂膠的化學成分非常復雜，從兩種肺癌細胞的抑制功效可以看出蜂膠藥效體現的是綜合效應和整體療效，蜂膠整體藥效的發揮不是單一成分藥效的簡單疊加，而是存在著復雜的相互作用和協同功效[13]。蜂膠的抗腫瘤作用機理也很可能是多網絡、多靶點的[14]，蜂膠抑制肺癌細胞增殖是否對其他信號通路及其靶點發揮功效還需要進一步發掘、研究。