煙酰胺核糖對酒精暴露小鼠抑郁樣行為及腸黏膜通透性改善效果

姜雨杉，劉 穎，王子龍，薛美蘭，常志尚，梁 惠,*

（1.青島大學公共衛生學院，山東 青島 266021；2.青島大學基礎醫學院，山東 青島 266071；3.青島大學生物醫學公共支撐平臺，山東 青島 266021）

抑郁癥作為一種常見的精神障礙，已被世界衛生組織列為全球殘疾或非致命健康損失首要單一因素，它也是造成全球疾病負擔以及自殺的主要因素之一[1-3]。酒精濫用是誘發抑郁癥的關鍵危險因素[4-5]，由此引發的嚴重危害已引起社會廣泛關注，并成為公共衛生領域研究熱點。腸道黏膜屏障是防止腸道內有害物質入侵機體內環境并維持其穩態的一道重要屏障[6-8]，腸黏膜屏障完整性的破壞與炎癥性腸病、酒精性肝病等多種疾病的發生發展密切相關[9-11]。多項研究表明，抑郁癥患者常伴有腸道屏障功能受損和腸黏膜通透性增加[12-13]。因此，修復腸黏膜損傷、減少腸滲漏，可望作為新的作用靶點用于抑郁癥防治。煙酰胺核糖（nicotinamide riboside，NR）作為一種VB3，主要來源于牛奶和酵母等[14]。近年來，多項研究發現，NR作為一種營養補充劑具有神經保護作用[15-17]，而神經可塑性、神經發生、神經營養狀態、神經元死亡等都與抑郁癥的發生密切相關[18-19]。但目前關于NR對酒精性抑郁改善效果及腸黏膜屏障修復作用的研究卻鮮有報道。本研究以酒精暴露小鼠為研究對象，探討NR對其抑郁樣行為的改善效果，并系統觀察NR對其腸黏膜通透性的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級7 周齡雄性C57BL/6J小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2016-0006。

NR（純度96%） 湖北巨勝科技有限公司；乙醇（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；組織蛋白提取試劑盒、蛋白檢測試劑盒 江蘇碧云天生物技術有限公司；occludin及ZO-1抗體 美國Cell Signaling Technolog公司；β-actin抗體及各相應二抗北京中山金橋生物技術有限公司；生物素（EZ-link Sulfo-NHS-Biotin） 美國Pierce Chemical公司；鏈霉親和素（Streptavidin DyLightTM488 Conjugated） 美國Thermo公司。

1.2 儀器與設備

DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠；JEM 1200型電子透射顯微鏡 日本JEOL公司；RM 2135型石蠟切片機德國LEICA公司；BX53熒光顯微鏡 美國Olympus公司；RT-6100型酶標儀 美國Rayto公司；ChemiDoc化學發光成像分析系統 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 模型建立與分組

30 只雄性C57BL/6J小鼠，隨機分為3 組：對照組、模型組和NR干預組（NR組），每組10 只。按以下方法進行酒精暴露和NR干預：每周一至周四8∶00～16∶00給予模型組和NR組小鼠新鮮配制的體積分數15%乙醇水溶液自由飲用，16∶00～8∶00給予其自來水自由飲用，對照組小鼠全天給予自來水自由飲用，周五和周六切斷3 組小鼠一切水源，周日給予3 組小鼠自來水自由飲用。每天8∶00～16∶00給予小鼠光照，16∶00～8∶00剝奪小鼠光照。于每天12∶00對各組小鼠進行灌胃處理，其中，對照組和模型組小鼠給予0.2 mL生理鹽水灌胃，NR組小鼠給予400 mg/kg mbNR灌胃。干預期間，各組小鼠自由進食。實驗持續10 周后，進行行為學檢測。隨后禁食不禁水12 h，40 mg/kg mb戊巴比妥鈉麻醉，眼球取血，分離血清，-80 ℃凍存；留取腦組織、空腸及結腸組織，部分用于病理學觀察及滲透性實驗，部分于-80 ℃凍存，用于后續檢測。

1.3.2 行為學檢測

所有行為學測試均于9∶00～12∶00在同一個光照微弱且安靜的房間內進行。于測試前2 h將小鼠引入該實驗室以充分適應實驗室環境。

1.3.2.1 曠場實驗

于酒精暴露10 周后進行曠場實驗，以評估小鼠的運動能力以及抑郁樣行為。曠場裝置是一個長寬高為40 cm×40 cm×30 cm的開放敞箱，內壁全部覆蓋白色涂層，上方裝有攝像機并連接電腦，使用SMART V3.0軟件在敞箱中央標出20 cm×20 cm的中央區域，并記錄分析小鼠的運動情況。每次測試前，使用蘸有體積分數75%乙醇溶液的棉球擦拭曠場內壁，以消除殘留的小鼠尿液、糞便、氣味等對待測試小鼠運動情況的影響。測試時，將小鼠由敞箱中央放入，適應性探索1 min，消除小鼠對新環境的緊張感以免影響其探索運動。記錄小鼠隨后7 min總運動距離和在中央區域的停留時間。

1.3.2.2 糖水偏好實驗

于酒精暴露前及暴露10 周后分別進行糖水偏好實驗。本研究參照文獻[20-21]報道的糖水實驗方案并進行了一定改進。在正式測試之前，為每只小鼠提供兩瓶1 g/100 mL蔗糖溶液，持續飲用24 h后，將其中一瓶蔗糖溶液換成自來水，繼續飲用24 h，以避免小鼠對蔗糖溶液這一新鮮事物產生恐懼。隨后，切斷小鼠一切飲水和食物，持續24 h后，進行糖水偏好測試。在實驗過程中，為每只小鼠提供一瓶1 g/100 mL蔗糖溶液和一瓶自來水使其自由飲用。并在小鼠飲用前、飲用后1 h和12 h時分別稱量瓶質量，以計算小鼠飲用蔗糖溶液和自來水的量。于第0.5小時和第6小時，分別交換兩個瓶子的位置，以避免小鼠位置偏好對實驗結果的影響。按下式計算小鼠糖水偏愛度。

1.3.2.3 強迫游泳實驗

于酒精暴露10 周后進行強迫游泳測試。將小鼠置于圓柱形玻璃容器中（高25 cm、直徑10 cm），水深10 cm，水溫（23±1）℃。每次實驗持續6 min，記錄小鼠在最后4 min的運動情況。抑郁小鼠在強迫游泳實驗中會出現“不動”狀態，主要表現為停止掙扎，被動地漂浮在水中，僅通過一些輕微動作以保持頭部浮在水面以上。本研究使用SMART v3.0軟件，將運動速率小于0.6 cm2/s作為小鼠“不動”的標準，每隔0.5 s進行一次判斷和記錄。每次強迫游泳實驗后，更換新鮮自來水，消除其對待測小鼠的干擾。測試結束后，將小鼠拭干，放回飼養籠中。

1.3.3 海馬組織病理學檢查

快速分離小鼠海馬組織，置于體積分數10%中性甲醛固定過夜，進行常規石蠟包埋，隨后進行連續切片，厚度為5～7 μm，脫蠟。行蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察各組小鼠海馬組織形態學變化。每組觀察5 張切片，每張切片觀察5 個視野。

1.3.4 血清中腦源性神經營養因子質量濃度檢測

采用酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）實驗檢測各組小鼠血清中腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）質量濃度，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.5 腸黏膜通透性檢測

1.3.5.1 血清脂多糖質量濃度檢測

采用ELISA實驗檢測各組小鼠血清中脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）質量濃度，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.5.2 空腸及結腸組織細胞連接裝置超微結構觀察

迅速留取小鼠空腸及結腸1 mm×2 mm組織塊，生理鹽水漂洗，體積分數2.5%戊二醛溶液固定。24 h后采用pH 7.2 PBS漂洗3 次，體積分數1%鋨酸溶液固定80 min，雙蒸水漂洗后，梯度丙酮脫水，環氧樹脂包埋。制備半薄切片用于組織定位，將定位后的樣品塊以70 nm厚度切片，質量分數3%醋酸雙氧鈾染色30 min，檸檬酸鉛染色15 min，雙蒸水沖洗，于透射電子顯微鏡下觀察腸上皮細胞連接裝置并拍攝。每組觀察5 張切片，每張切片觀察5 個視野。

1.3.5.3 空腸及結腸組織滲透性示蹤實驗

取空腸和結腸中部2 cm，將一端結扎，采用小鼠灌胃針從另一端緩慢注入2 mg/mL生物素，之后將另一端結扎。室溫孵育5 min，體積分數4%多聚甲醛固定3 h以上，冰PBS漂洗3 次，每次3 min。將灌注樣品制備成5 μm厚度石蠟組織切片，與鏈霉親和素（1∶500稀釋）在暗室共孵育30 min。利用熒光顯微鏡觀察生物素在腸道中分布情況。每組觀察5 張切片，每張切片觀察5 個視野。

1.3.5.4 空腸及結腸組織緊密連接相關蛋白表達水平檢測

采用Western blot檢測空腸及結腸組織中occludin及ZO-l蛋白表達水平，以β-actin作為內參，結果經化學發光成像分析系統進行定量檢測和圖片采集。實驗重復3 次。

1.4 數據統計與分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據統計分析，多組間比較采用單因素方差分析，以±s表示，P＜0.05被認為有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 煙酰胺核糖對酒精暴露小鼠認知功能損傷和行為的影響

曠場實驗結果顯示，模型組小鼠的總運動距離和中央區域停留時間較對照組分別縮短了15.9%和27.7%，NR組小鼠則較模型組分別升高了10.5%和18.5%，但3 組間比較均未見顯著性差異（P＞0.05）（圖1B）。糖水偏好實驗結果顯示，酒精暴露前，各組小鼠1 h和12 h的糖水偏愛度均未見顯著性差異（P＞0.05）；酒精暴露10 周后，3 組小鼠1 h糖水偏愛度無明顯差異，但12 h后，模型組小鼠糖水偏愛度較對照組顯著降低了15.1%，NR組小鼠則較模型組顯著提高了21.0%（P＜0.05）（圖1C2）。強迫游泳實驗結果顯示，模型組小鼠不動時間達到（168.6±34.4）s，與對照組（（107.9±47.4）s）相比，顯著延長了56.3%，NR補充使小鼠不動時間達到（95.8±24.8）s，較模型組明顯縮短了43.2%（P＜0.05）（圖1D）。

圖1 煙酰胺核糖對酒精暴露小鼠抑郁樣行為的影響Fig. 1 Effect of NR on depression-like behavior in mice

2.2 煙酰胺核糖對酒精暴露小鼠海馬組織病理學的影響

圖2 煙酰胺核糖對酒精暴露小鼠海馬組織病理學的影響（×400）Fig. 2 Effect of NR on hippocampal histopathology in mice (× 400)

由圖2可知，對照組和NR組小鼠海馬組織CA1區細胞形態完整規則，排列整齊有序；模型組小鼠海馬組織CA1區表現為部分胞體空染，細胞排列無序化，有部分不規則狀的深染細胞，提示神經元損傷甚至死亡。

2.3 煙酰胺核糖對酒精暴露小鼠血清BDNF水平的影響

圖3 煙酰胺核糖對酒精暴露小鼠血清BDNF質量濃度的影響Fig. 3 Effect of NR on serum BDNF level in mice

由圖3可知，模型組小鼠血清BDNF質量濃度達到（438.9±46.7）pg/mL，與對照組（（638.1±77.3）pg/mL）相比，顯著降低了31.2%；NR干預后，小鼠血清BDNF質量濃度達到（735.7±55.7）pg/mL，較模型組顯著增加了67.6%，經統計學分析，均具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.4 煙酰胺核糖對酒精暴露小鼠腸黏膜通透性的影響

圖4 煙酰胺核糖對酒精暴露小鼠血清LPS水平的影響Fig. 4 Effect of NR on serum LPS level in mice

由圖4可知，對照組血清LPS質量濃度為（13.2±3.0）ng/mL，模型組達到（22.5±1.8）ng/mL，較對照組顯著升高了70.5%（P＜0.05）；透射電子顯微鏡結果顯示，模型組小鼠空腸及結腸黏膜上皮細胞緊密連接模糊，電子密度降低，中間連接縫隙異常增寬；示蹤實驗結果顯示，模型組小鼠空腸和結腸組織生物素示蹤劑向黏膜下層滲透（圖5）；Western blot結果發現（圖6），與對照組比較，模型組小鼠空腸及結腸occludin和ZO-1蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。NR補充使酒精暴露小鼠血清LPS質量濃度較模型組減少，達到（17.5±0.3）ng/mL（圖4）；空腸及結腸黏膜上皮細胞連接裝置得到明顯修復（圖5）；腸黏膜滲透性降低；occludin和ZO-1蛋白表達水平亦出現不同程度升高，其中，空腸ZO-1蛋白表達水平較模型組顯著升高（P＜0.05）（圖6）。

圖5 煙酰胺核糖對酒精暴露小鼠腸黏膜超微結構和滲透性的影響Fig. 5 Effect of NR on intestinal mucosal ultrastructure and permeability in mice

圖6 煙酰胺核糖對酒精暴露小鼠空腸及結腸組織occludin和ZO-l蛋白表達水平的影響Fig. 6 Effect of NR on the expression of occludin and ZO-l in jejunum and colon of mice exposed to alcohol

3 討 論

多項研究表明，NR作為一種營養補充劑具有神經保護作用。王柔昕等[22]研究發現，NR可有效改善母嬰隔離后青春期大鼠抑郁樣行為，并提高其空間學習記憶能力。Brenner等[23]研究發現，與常規飼料喂養的母鼠相比，飼料里添加了NR的母鼠其乳汁中含有更多的BDNF，其子代的成年后代更少表現出焦慮和抑郁樣行為，且空間記憶力能力更強。Hou Yujun等[15]研究發現，NR可顯著地恢復AD模型小鼠神經炎癥、突觸可塑性和DNA損傷，并改善小鼠學習記憶和運動功能。上述研究均表明，NR對部分中樞神經系統病變具有良好的修復作用，但尚不清楚其對酒精性抑郁是否同樣具有預防和保護作用。本研究以NR為干預物，通過一系列行為學、病理學和生物標志物檢測，觀察其對酒精暴露小鼠抑郁樣行為的改善效果；并采用多種腸黏膜通透性檢測方法，探討NR改善抑郁樣行為可能的腸道屏障功能作用機制。

曠場實驗、糖水偏好實驗和強迫游泳實驗是目前評價動物模型抑郁樣行為的常用方法[24-27]。本研究結果發現，酒精暴露導致了小鼠典型抑郁狀態的發生。如在曠場實驗中，總運動距離的減少及其在中央區域停留時間的縮短，表明酒精暴露小鼠在面對新環境時的探索能力、好奇心及適應能力均受到明顯影響；強迫游泳實驗中不動時間的顯著延長，表明酒精暴露小鼠表現出一定程度行為絕望狀態；同時，糖水偏愛度的顯著降低也提示酒精暴露小鼠欣快感的缺失。研究結果還發現，NR補充能夠提高小鼠運動能力和探索行為，顯著緩解小鼠絕望、淡漠等抑郁樣行為，表明NR對酒精暴露小鼠抑郁樣行為具有一定預防和保護作用。

為了進一步明確酒精暴露小鼠的抑郁樣狀態以及NR對其的預防和保護作用，本研究進行了小鼠海馬組織病理學檢查及BDNF血清學檢測。海馬是抑郁癥最常累及的大腦區域，它對下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸的活動具有抑制作用，并廣泛地參與機體認知功能和情感處理[28-29]。多項研究表明，抑郁癥患者存在海馬區神經元損傷及死亡[18,30]。BDNF是在腦組織中合成的一種蛋白質，廣泛分布于中樞神經系統[31]。它在抑郁癥的學習記憶、認知功能和情緒障礙等病理生理學改變的調節中發揮關鍵作用[32-33]。血清BDNF含量可在一定程度上反映腦組織BDNF水平，它被認為是抑郁癥發生發展及藥物療效評價可能的生物標志物之一[34-35]。Bus等[34]對1 751 人持續2 年的隨訪研究及Molendijk等[36]對179 項研究進行的系統回顧和薈萃分析發現，抑郁癥患者常伴隨血清BDNF含量的顯著減少，抗抑郁治療后血清BDNF水平隨之恢復正常。本研究結果發現，酒精暴露小鼠海馬組織出現神經細胞損傷，且血清BDNF水平顯著降低，而NR干預后均得到明顯改善，表明除了典型的抑郁樣行為外，酒精暴露小鼠也出現明顯的抑郁樣病理和生理學改變，從而進一步證實了本研究已成功建立酒精性抑郁的小鼠模型，并進一步肯定了NR對小鼠酒精性抑郁具有一定的預防和保護作用。

近年來，研究發現抑郁癥會伴隨腸黏膜屏障損傷[12-13]，修復腸黏膜屏障也因此成為藥物改善抑郁狀態潛在的作用靶點。腸黏膜上皮細胞連接裝置對于維持腸黏膜屏障的完整性至關重要[10]，主要由緊密連接、黏附連接、縫隙連接和橋粒組成[11]，其中，緊密連接是腸黏膜上皮細胞間最主要的連接方式，occludin是緊密連接中主要跨膜蛋白和功能蛋白，它與支架蛋白ZO-1及其他跨膜蛋白及黏附分子共同構成細胞間穩定的緊密連接體系，參與腸黏膜屏障功能調節[37-38]。LPS是腸道中革蘭氏陰性菌代謝產物，如腸黏膜屏障遭到破壞，腸黏膜通透性增高，LPS等有毒物質便可大量釋放入血，引發腸滲漏及多種炎癥性疾病的發生[39-41]。本研究檢測結果發現，酒精暴露小鼠存在腸黏膜通透性和血清LPS異常增高的現象，NR補充使腸黏膜緊密連接等細胞連接裝置得到有效修復，滲透性降低，血清LPS含量也出現一定程度的下降。以上結果均表明，NR補充可使小鼠腸黏膜屏障損傷狀況得到有效緩解和改善，這可能是NR對小鼠酒精性抑郁發揮預防和保護作用的機制之一。

綜上，NR作為一種重要的營養補充成分，可有效緩解酒精暴露小鼠抑郁樣行為，其作用機制可能與NR對酒精性抑郁小鼠腸黏膜通透性的修復作用有關。這些新發現為合理補充膳食營養素以改善人體健康提供了科學依據。