原花青素對鐵超載大鼠腎臟鐵含量、氧化應(yīng)激及Fas、Bax基因表達的影響

云少君，褚東陽，何興帥，張文芳，馮翠萍*

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801）

鐵元素廣泛存在于各種生物體中[1-2]。體內(nèi)鐵過量除會發(fā)生Fenton反應(yīng)外[3]，還能夠直接和不飽和脂肪酸結(jié)合，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化[4]。體內(nèi)過量的鐵可以在多種組織諸如肝臟、心臟和腎臟中蓄積，導(dǎo)致相應(yīng)臟器的氧化損傷。研究表明，體內(nèi)鐵過量可以引起腎臟功能性異常，如尿毒癥和腎癌等[5-6]。因此，體內(nèi)鐵代謝的平衡對于機體的健康是至關(guān)重要的。

目前臨床上對抗鐵負(fù)荷的方法主要是采用藥物治療，多采用一些重金屬螯合劑[7]，如去鐵胺、去鐵酮等。藥物的治療雖然迅速有效，但是多伴隨著如皮膚紅疹、惡心、嘔吐等副作用。此外，機體抗氧化能力的提升也被認(rèn)為是對抗鐵負(fù)荷所致氧化損傷的有效措施，已有研究表明，使用抗氧化蛋白[8]、大麻二酚[9]以及金花草[10]等一些中草藥都能夠改善鐵過量造成的損傷。

原花青素（proanthocyanidins，PAs）擁有很強的生物活性和藥理作用[11-13]。體內(nèi)外實驗均表明，PAs能夠抑制自由基生成，提高抗氧化酶的活性，其清除氧自由基的能力要強于VC、VE以及β-胡蘿卜素[14-15]。同時，PAs所含的酚類結(jié)構(gòu)亦是有效的鐵螯合劑[16]。葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidins，GSPAs）含量豐富，其作為營養(yǎng)補充劑被人們廣泛使用。而本課題組之前的實驗結(jié)果表明GSPAs能夠抑制大鼠吸收大豆鐵蛋白中的鐵；在單純給予缺鐵大鼠安全攝入量范圍的GSPAs后，缺鐵大鼠均出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，而缺鐵對照組大鼠則未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象[17]。目前，針對PAs的研究多集中在其抗氧化特性上，對于其如何影響機體鐵代謝尚不清楚，而過量的鐵會對腎臟功能產(chǎn)生損傷，原花青素是否對這一作用有抑制和改善作用尚未得知。因此，本實驗擬通過構(gòu)建鐵超載大鼠模型，進一步探究GSPAs對鐵超載的營養(yǎng)改善作用及其機制，為開發(fā)安全、高效的控鐵制劑提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性SD大鼠（8 周齡）由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001。

GSPAs（多聚體純度為95%） 天津尖峰有限責(zé)任公司；血清總鐵結(jié)合力（total iron binding capacity，TIBC）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、總抗氧化力（total antioxidant activity，T-AOC）、肌酐（creatinine，CR）和尿素氮（urea nitrogen，BUN）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；RNAiso Plus、SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒、PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒、Loading Buffer 日本TaKaRa公司；DNA Marker 華美生物工程公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC） 上?；瞪锛夹g(shù)有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ADVIA 2120型全自動血液分析儀 德國西門子公司；Optima 5300DV電感耦合等離子發(fā)射光譜儀美國PerkinElmer公司；BX51型顯微鏡 日本Olympus公司；BioPhotometer plus核酸蛋白分析儀 德國Eppendorf公司；DYCP-31CN型瓊脂糖凝膠電泳儀北京六一生物科技有限公司；Mx3000P實時熒光定量PCR（real-time PCR，qPCR）儀 美國Stratagene公司。

1.3 方法

1.3.1 動物與分組

40 只雄性SD大鼠適應(yīng)環(huán)境7 d后隨機分成對照組（NC組）、鐵超載模型組（Model組）、原花青素組（GSPAs組）、實驗組（Test組）。大鼠自由攝食、飲水。參照文獻[18]的方法，Model組和Test組隔天腹腔注射右旋糖酐鐵（100 mg/kgmb），GSPAs組和Test組大鼠每天灌胃100 mg/kgmb的GSPAs，以生理鹽水消除應(yīng)激性誤差。10 d實驗期結(jié)束后，取大鼠腎臟組織并保存于-80 ℃。

1.3.2 紅細(xì)胞、血紅蛋白及TIBC的測定

取大鼠血液測定紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）數(shù)目及血紅蛋白（hemoglobin，Hb）水平，依試劑盒說明書測定TIBC。

1.3.3 腎臟組織Fe含量測定

將濃硝酸與高氯酸以4∶1體積比加入一定量腎臟組織中，搖勻并封口，于室溫下靜置過夜，使其完全消解。次日緩慢低溫加熱進行消化，直到三角瓶中的液體變得澄清透明后停止加熱，冷卻后過濾，以體積分?jǐn)?shù)1%稀硝酸溶液定容之后，通過電感耦合等離子體質(zhì)譜檢測Fe含量。

1.3.4 腎臟氧化應(yīng)激狀態(tài)的檢測

按照相應(yīng)試劑盒說明書對GSH-Px、SOD、MDA水平以及T-AOC進行測定。

1.3.5 CR及BUN濃度的測定

根據(jù)試劑盒說明書檢測CR及BUN的水平。

1.3.6 腎臟組織HE染色及觀察

參照文獻[19]的方法，按照常規(guī)操作對HE染色后的腎臟組織進行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.7 逆轉(zhuǎn)錄qPCR檢測Fas、Bax基因的表達

將1 mL RNAiso Plus加入至30～50 mg腎臟組織中，充分勻漿后提取RNA。檢測RNA的濃度及純度后，將3 μL的PrimeScriptTMRT Master Mix和一定量的總RNA提取物加入EP管中，并用RNase Free ddH2O加至15 μL（反應(yīng)液的配制在冰浴上進行），輕柔混合，按照37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃保存的條件進行反轉(zhuǎn)錄。之后按照95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、62 ℃ 34 s（42 個循環(huán)）；95 ℃ 15 s、62.8 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s的條件進行PCR擴增。引物序列為：β-actin：（5’-3’）上游：TACCCAGGCATTGCTGACAG；下游：AGCCACCAATCCACACAGAG。Fas：上游：CGCAGCGGTTAGCTTTTCTG；下游：ATTTGCTCGGCAGCACAAGA。Bax：上游：TGGCGATGAACTGGACAACA；下游：CCCAGTTGAAGTTGCCGTCT。最后用MXPro-MX3000P軟件對數(shù)據(jù)進行處理。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 16.0軟件，進行方差齊性檢驗之后選用單因素方差分析，再以Tukey法進行均數(shù)間的兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠RBC數(shù)目、Hb含量及TIBC

圖1 GSPAs對鐵超載大鼠RBC數(shù)目、Hb質(zhì)量濃度和TIBC的影響Fig. 1 Effect of GSPAs on RBC content, Hb concentration and TIBC of rats with iron overload

由圖1可見，Model組較NC組，大鼠血液中的RBC、Hb水平升高，TIBC降低；GSPAs組與NC組相比，Hb質(zhì)量濃度極顯著升高（P＜0.01）。與Model組比較，Test組中的RBC數(shù)目、Hb質(zhì)量濃度顯著降低，TIBC顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2 大鼠腎臟組織的鐵含量

圖2 GSPAs對鐵超載大鼠腎臟Fe含量的影響Fig. 2 Effect of GSPAs on renal iron content of rats with iron overload

由圖2可見，相較于NC組，Model組腎臟Fe含量極顯著升高（P＜0.01），GSPAs組Fe含量無明顯變化。與Model組相比較，Test組Fe含量降低，但差異不顯著。

2.3 大鼠腎臟組織氧化應(yīng)激狀態(tài)

圖3 GSPAs對鐵超載大鼠腎臟GSH-Px、SOD活力、MDA含量、T-AOC的影響Fig. 3 Effect of GSPAs on GSH-Px activity, SOD activity, MDA content and T-AOC of kidney tissues in rats with iron overload

由圖3可見，與NC組比較，Model組中的GSH-Px、SOD活力顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），T-AOC差異不顯著，MDA含量顯著升高（P＜0.05）；GSPAs組大鼠GSH-Px、SOD活力和MDA含量差異不顯著，T-AOC極顯著升高（P＜0.01）。與Model組比較，Test組中GSH-Px、SOD活力以及T-AOC顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。

2.4 大鼠CR和BUN水平

圖4 GSPAs對鐵超載大鼠CR和BUN濃度的影響Fig. 4 Effect of GSPAs on CR and BUN levels in rats with iron overload

從圖4可見，相比NC組，Model組中的CR和BUN濃度極顯著升高（P＜0.01）；GSPAs組差異不顯著。Test組較Model組CR、BUN濃度極顯著降低（P＜0.01）。

2.5 大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)變化

HE染色結(jié)果（圖5）顯示各組大鼠腎臟無明顯的形態(tài)學(xué)改變，腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊。

2.6 大鼠腎臟組織Fas和Bax的相對表達量

圖6 GSPAs對鐵超載大鼠腎臟Fas和Bax基因表達的影響Fig. 6 Effect of GSPAs on mRNA expression levels of Fas and Bax in rats with iron overload

由圖6可知，較之NC組，Model組大鼠腎臟組織Fas的表達量顯著升高72.17%（P＜0.05）；GSPAs組中Fas的表達量顯著降低62.94%（P＜0.05）。與Model組進行比較，Test組、GSPAs組中Fas的表達量分別極顯著降低44.98%和78.48%（P＜0.01）。相較于NC組，Model組大鼠腎臟組織Bax表達量顯著上調(diào)23.79%（P＜0.05）；GSPAs組中Bax表達量降低30.67%，但差異不顯著。相比Model組，Test組、GSPAs組中Bax的表達量分別極顯著下調(diào)23.78%、43.99%（P＜0.01）。

3 討 論

機體的鐵穩(wěn)態(tài)對于細(xì)胞活動及生命的維持至關(guān)重要，而鐵過量則會對機體產(chǎn)生一系列的損傷作用。本實驗首先通過腹腔注射右旋糖酐鐵的方法構(gòu)建了鐵超載大鼠模型，并試圖進一步通過補充GSPAs探討其對機體鐵過量的影響。

機體內(nèi)鐵含量直接關(guān)系到Hb的水平和質(zhì)量[20]。TIBC則可以反映機體中轉(zhuǎn)鐵蛋白的水平，從而間接反映機體的鐵水平。本研究中大鼠補充過量的鐵后，其RBC、Hb水平顯著升高，TIBC顯著降低。而Test組在補充GSPAs后，以上指標(biāo)均發(fā)生顯著性逆轉(zhuǎn)。研究發(fā)現(xiàn)多酚提取物可調(diào)控鐵代謝相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體[21]。Li Changhong等[22]的研究發(fā)現(xiàn)多酚可直接清除氧自由基，同時還可螯合鐵離子。結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果[17]，推測本實驗中GSPAs同樣通過其螯合特性拮抗了鐵過量的發(fā)生，使體內(nèi)鐵水平趨于正常。

為了進一步探討GSPAs對于機體鐵水平的影響，選取鐵過量時鐵沉積最為常見的腎組織進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在補鐵10 d后，Model組大鼠腎臟組織中鐵含量極顯著升高，而鐵負(fù)荷大鼠同時給予GSPAs干預(yù)后，其腎臟組織中鐵含量雖無顯著差異，但有下降趨勢。與以上結(jié)果保持一致，說明GSPAs通過螯合鐵離子，有降低其在腎臟組織中沉積的作用。

過多的鐵沉積在腎臟處會通過氧化應(yīng)激產(chǎn)生腎毒性，推動腎病的發(fā)生[23]。本實驗發(fā)現(xiàn)Model組大鼠腎臟組織發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激，而GSPAs可顯著改善這一狀態(tài)。研究表明，PAs能直接清除活性氧自由基、螯合金屬離子，進而降低其氧化特性[24]。此外，其能夠誘導(dǎo)內(nèi)生的抗氧化酶的活性進而發(fā)揮間接的抗氧化特性[25]。另有研究發(fā)現(xiàn)GSPAs可以提高腎臟組織的抗氧化能力[26]。本研究同樣表明鐵過量導(dǎo)致了腎臟組織的氧化應(yīng)激，而GSPAs則對鐵超載所致大鼠腎臟氧化損傷具有明顯的拮抗效應(yīng)。

此外，腎組織的損傷程度可以通過CR、BUN水平以及組織形態(tài)學(xué)來反映。CR的含量在一定程度上能夠反映腎小球的濾過率，腎臟功能障礙越嚴(yán)重，血漿中CR含量越高[27]。同時腎小球濾過功能受損也會導(dǎo)致血漿中的BUN含量增高[28-29]。本實驗中，Model組大鼠CR、BUN含量明顯升高，說明鐵過量引起了大鼠腎臟功能受損，與之前報道結(jié)果一致[30-31]。而鐵超載大鼠進行GSPAs干預(yù)后，大鼠血清中的CR、BUN濃度極顯著降低，說明GSPAs以其螯合金屬以及抗氧化的特性對由鐵超載而導(dǎo)致的腎臟功能損傷產(chǎn)生了拮抗作用。本實驗進一步從組織形態(tài)學(xué)觀察鐵超載對腎臟的影響，但是未發(fā)現(xiàn)鐵過量大鼠腎臟組織出現(xiàn)病理損傷，推測可能是由于鐵超載的建模時間太短，從而未對腎臟組織造成可見的病理性損傷。GSPAs的補充同樣也未對腎臟組織形態(tài)學(xué)產(chǎn)生明顯影響。

凋亡是在疾病進程中淘汰有害細(xì)胞的一個必需的生理過程，而先前的研究顯示凋亡與氧化應(yīng)激有著密切的聯(lián)系[32]。為了進一步探討GSPAs對于鐵過量所致腎組織損傷的保護作用，進一步探討了其對腎臟組織凋亡的影響。研究表明，F(xiàn)as和Bax是體內(nèi)重要的凋亡誘導(dǎo)蛋白[33]。本實驗中發(fā)現(xiàn)Model組大鼠腎臟組織中的Fas及Bax基因表達顯著上調(diào)，而GSPAs的干預(yù)對Fas、Bax基因的表達具有抑制作用。這可能是由于過量的鐵能夠引起氧化應(yīng)激，從而刺激特定的凋亡途徑，進而啟動細(xì)胞凋亡。GSPAs則能夠有效清除自由基，并且螯合部分鐵，從而抑制凋亡相關(guān)信號，使得Fas、Bax基因表達下調(diào)。

綜上，機體鐵超載可以引起機體鐵含量升高、腎臟氧化應(yīng)激、肌酐和尿素氮含量升高以及Fas、Bax基因表達的上調(diào)，而GSPAs則可通過螯合鐵和抗氧化特性對鐵過量產(chǎn)生的效應(yīng)進行拮抗，從而對鐵超載所致的腎損傷起到保護作用。