芬太尼類藥物色譜質譜聯用檢測方法研究

陳庚超，郭媛媛，魯志超，楊雪嬌

(黃埔海關技術中心，廣東 東莞 523000)

芬太尼類藥物常見的有芬太尼和去甲芬太尼(芬太尼英文名：Fentanyl，分子式C22H28N2O3，CAS號：437-38-7；去甲芬太尼英文名：N-Phenyl-N-(4-piperidiny)propanamide，分子式C14H20N2O，CAS號：1609-66-1)，為阿片類受體激動劑，屬強效麻醉性鎮痛藥，藥理作用與嗎啡類似[1]。可適用于各種疼痛及外科、婦科等手術后和手術過程中的鎮痛；也可用于防止或減輕手術后出現的譫妄，還可與麻醉藥合用，作為麻醉輔助用藥[2-3]。近年來，芬太尼類物質的新型合成毒品在美國、加拿大等國迅速發展蔓延，由于該類物質毒性強、品種多、變異快、緝查難，已成為當前國際禁毒領域面臨的一大難題[4-5]。2019年 4月1日，公安部、國家衛生健康委員會、國家藥品監督管理局聯合發布《關于將芬太尼類物質列入非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補目錄的公告》，公安部、國家衛生健康委員會、國家藥品監督管理局決定將芬太尼類物質列入《非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補目錄》，正式將“芬太尼類物質”按類納入毒品管制范疇。現階段還未出臺快速、準確，高效的檢測標準[6-7]，所以本文旨在使用超高效液相色譜質譜串聯三重四級桿質譜儀建立具有高準確性、及時性的檢測方法，這對于新型芬太尼類毒品檢測管制具有十分重要的意義。

1 實 驗

1.1 儀 器

Waters Quattro Preminer XE+UPLC超高效液相色譜儀串聯三重四級桿質譜儀,Waters公司；MS304電子分析天平，梅特勒-托利多儀器公司；Elmasonic P超聲波清洗器，德國Elma儀器公司；Allegra X-30多功能臺式高速離心機，貝克曼庫爾特商貿有限公司；Seven Easy pH計，梅特勒-托利多儀器公司；Milli-Q IQ7000超純水儀，默克密理博公司。

1.2 試 劑

芬太尼、去甲芬太尼、同位素內標氘代芬太尼標準品，純度大于98%。甲醇(色譜純)；乙腈(色譜純)；甲酸(色譜純)；乙酸(色譜純)；醋酸銨(分析純)；氯化鈉(分析純)；氨水(優級純)；實驗用水除特殊說明外均為一級水。

1.3 標準溶液配制

分別稱取芬太尼、去甲芬太尼、D5-芬太尼標準品適量，用甲醇溶解，配制成質量濃度為1000 mg/mL的單標儲備液，吸取適量標準儲備液用甲醇做溶劑配制成1.00 mg/L的標準溶液，再用甲醇做溶劑將標準溶液稀釋成濃度為1.00、5.00、10.00、20.00、50.00和100.00 ng/mL的系列標準工作溶液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 血液、尿液等組織液樣品

準確稱取該類樣品10.00 g(液體樣品也可準確移取10 mL)于50 mL離心管中，加入適量內標標準溶液，加入20 mL乙腈、約3.5 g氯化鈉，充分搖勻后渦旋震蕩提取30 min(300 r/min)，8000 r/min充分離心5 min后準備進行固相萃取[8]。

取4 mL上述離心上清液過HLB小柱(HLB柱使用前依次用3 mL甲醇、3 mL超純水活化)，待樣液流干后，依次用3 mL水淋洗，棄去淋洗液抽干，然后用6 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，氮氣吹干，最后用1.00 mL甲醇定容，過0.22 μm有機系濾膜后待上機測試[9]。

1.4.2 芬太尼類原藥樣品

準確稱取0.100 g原藥樣品于100 mL容量品中，用約80 mL甲醇溶解后，30 ℃超聲10 min，降溫至室溫后用甲醇定容。然后在按比例稀釋10000后，加入適量內標，過0.22 μm有機系濾膜后待上機測試。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件的優化

在儀器方法開發過程中，我們分別使用了0.2 mmol/L的醋酸銨水溶液、0.1%的甲酸水溶液、甲醇、乙腈等作為流動相進行不同梯度洗脫程序的測試[10]，進過比較各目標化合物峰形和峰面積相應，最終確定了以0.1%的甲酸水溶液+甲醇作為流動相的洗脫程序作為色譜條件，

色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC BEHC18(2.1×100 mm，1.7 μm)，進樣量10 μL，柱溫35 ℃，流動相為0.1%甲酸的超純水溶液+甲醇，梯度洗脫程序見表1，流速0.3 mL/min[11]。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.5.2 質譜條件的優化

將標準工作液注入質譜儀器，經多次優化各個部分條件，達到最佳靈敏度，各條件設置如下述：

(1)毛細管電壓：1.20 kV；

(2)錐孔電壓：30 V；

(3)離子源溫度：110 ℃；

(4)錐孔反吹氣流量：60 L/hr；

(5)脫溶劑氣氣體溫度：650 ℃；

(6)脫溶劑氣氣體流量：300 L/hr；

(7)碰撞氣氣體流量：0.10 mL/min。

霧化器、輔助加熱氣、碰撞氣等均為高純液氮或等效氮氣發生器，儀器使用前應調節各氣體流量以使質譜靈敏度達到檢測要求[12]。

質譜參數：正離子電噴霧ESI，多反應監測MRM模式，離子對信息見表2[13]。

表2 芬太尼類化合物質譜參數信息Table 2 Mass spectrum parameters of fentanyl compounds

標準工作溶液經上機測試，在充分優化色譜質譜條件后得到了理想色譜圖，如圖1中所示。

圖1 5.00 ng/mL的芬太尼標準品的總離子流色譜圖和MRM模式離子對圖Fig.1 Total ion flow chromatogram and MRM mode ion pair diagram of 5.00 ng/mL fentanyl standard

2 結果與討論

2.1 結果計算和表述

本方法按標準曲線內標法定量，按式(1)計算樣品中芬太尼、去甲芬太尼殘留量。計算結果需扣除空白值。

(1)

式中：W——樣品中目標化合物殘留量，μg/kg

C——芬太尼、去甲芬太尼在標準曲線內標法中計算出的目標化合物濃度，ng/mL

V1——乙腈提取液總體積，mL

V2——分取提取液體積，也即為過柱子樣品上清液總體積，mL

V3——最后樣品定容體積，mL

M——取樣總質量，g

在重復性條件下測得的兩次平行獨立測試結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%，結果保留三位有效數字。

2.2 線性范圍及檢出限

實驗室配置標準溶液濃度為1.00、5.00、10.00、20.00、50.00和100.00 ng/mL的系列標準工作溶液，按本方法經儀器上機測試后，以化合物濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標做線性回歸方程，芬太尼、去甲芬太尼線性相關系數均在R2=0.99以上，符合實驗檢測的要求，所以本文所述的線性范圍5.00～100 ng/mL。采用1.00 ng/mL標準溶液色譜圖，以3倍信噪比(S/N)來計算檢出限[14]，確定本方法芬太尼、去甲芬太尼的檢出限均為0.50 ng/mL，定量限均為1.00 ng/mL。

2.3 精密度及回收率

稱取不含待測組分的某尿液樣品10.00 g共20份，其中2份按照實驗方法進行處理作為對照組[15]，另外18份樣品分成3組，分別按三水平六平行的原則添加混合標準溶液，制成10、20和100 μg/kg 的3組不同濃度的樣品進行添加回收試驗，實驗結果平均回收率為85%～110%之間，RSD為RSD≤5(n=6)，回收率和精密度見表3[16]。

表3 回收率和精密度(n=6)Table 3 Recovery and precision (n=6)

3 結 論

本文采用同位素內標稀釋結合SPE固相萃取技術，超高效液相色譜串聯三重四級桿質譜聯用儀的檢測方法對常見芬太尼類藥物進行檢測分析，該方法不僅前處理簡單、提取效率高、操作方便等優點外，還具有準確度高、低檢出限，高靈敏度及精密度等特點，能夠符合實驗室對常見芬太尼類藥物的確證工作要求。