都勻毛尖茶多酚氧化酶粗酶的酶學性質*

姚玉仙，張明澤，劉麗萍，徐 波

(黔南民族師范學院，貴州 都勻 558000)

茶產業是貴州省黔南州近年來進行農業結構調整、推進扶貧開發的重要產業之一[1]。黔南州茶樹種質資源豐富，目前發現有200多個株系，既有適制綠茶的品系，也有適制紅茶的品系，部分品系可兼制紅綠茶[2]。為發展茶產業，實現多元化經營，茶產品類型逐漸增加，參照金駿眉加工工藝，利用都勻毛尖茶相同原料生產的都勻紅茶產量迅速增長，其品質也獨樹一幟[3]。紅茶發酵過程中主要生化成分變化是由多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO，EC 1.10.3.1)催化引起的。PPO是一種Cu2+輔基結合酶[4]，其催化形成的茶黃素總含量與紅茶整體品質及估值呈極顯著正相關[5]，是形成紅茶色澤與香氣的關鍵酶。不同地區和不同品種茶樹的PPO特性差異較大，酶的最適反應條件也有所差異[6]。因此，為進一步了解都勻地方茶樹品種的酶學性質，本研究以都勻毛尖茶地方品種鮮葉為對象，研究其酶的最適反應條件，為篩選適制都勻紅茶的茶樹品系及優化茶葉加工提供參考。

1 實 驗

1.1 材 料

材料：于夏季采摘都勻毛尖地方品種茶樹鮮葉，采摘規格為一芽一葉。

試劑：石英砂(SiO2)、冷丙酮(C3H6O)、檸檬酸(C6H8O7)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉(H2NaPO4·2H2O)、不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、鄰苯二酚(C6H6O2)、脯氨酸，所有化學試劑均為分析純級，所有用水均為蒸餾水。

1.2 方 法

1.2.1 粗酶提取[7]

取鮮葉10 g、冷丙酮40 mL、PVPP 2 g于冷凍的研缽中，快速研磨直至勻漿，抽濾，濾渣用80%冷丙酮淋洗至無色，此時濾渣即是丙酮粉。將1∶3(重量體積比)的丙酮粉和pH 5.6的檸檬酸-磷酸緩沖液混合，加入少量石英砂混合置于低溫環境中的冰研缽中研磨勻漿20 min，將勻漿好的混合液于4000 r/min的高速冷凍離心機(溫度4 ℃)離心15 min，得上清液，即PPO粗酶液，4 ℃保存備用。

1.2.2 酶活力測定[7]

取粗酶液1 mL，加反應混合液3 mL(2 mL pH 5.6檸檬酸磷酸緩沖液、0.4 mL 0.1%脯氨酸溶液、0.6 mL 0.1 mol·L-1鄰苯二酚溶液)在37 ℃下溫浴10 min后立即加入6 mol·L-1尿素液3 mL終止反應，4000 r/min離心10 min，上清液置于1 cm比色皿，在波長460 nm處測吸光度，空白對照的反應混合液中的鄰苯二酚用緩沖液代替，其他條件相同。酶活力單位以每克樣品每分鐘A460改變0.01為一個活力單位(U)。

式中，V為樣品體積，mL；T為反應時間，min；A460為反應終止時以空白為對照在460 nm處的吸光度。

1.2.3Km及vmax值測定

于五支離心管中加入酶液0.6 mL，分別加入0.1 mol·L-1鄰苯二酚溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，再用pH 5.6檸檬酸-磷酸緩沖液補充至3.0 mL，按照1.2.2步驟處理后測定吸光度。按以下公式計算Km值和vmax值。

式中，U為測得的酶活力，Km為米氏常數，mol·L-1；v為酶促反應速率，vmax為酶的最大反應速率，U/min；[S]為底物濃度，mol·L-1。采用雙倒數方程計算出Km和vmax的值，即是1/v=(Km/vmax)×(1/[S])+1/vmax，以底物濃度倒數(1/[S])為橫坐標，反應速率倒數(1/v)為縱坐標，通過求得兩者的線性函數關系，推出Km值和vmax值[8]。

1.2.4 不同溫度和pH處理后測定PPO酶活力

在試管中加入PPO酶液0.6 mL、0.1 mol·L-1鄰苯二酚0.6 mL、pH 5.6檸檬酸-磷酸緩沖液1.8 mL混勻作為反應體系溶液(不同pH處理的反應體系與此相同)，分別在20～70 ℃(10 ℃為一個梯度變化)下水浴10 min，測定各溫度下PPO的吸光度。pH 3.0～8.0(pH 0.5為一個梯度變化)的反應體系溶液于37 ℃水浴10 min后測定混合液PPO的吸光度。pH 3.0～5.5緩沖液用檸檬酸和磷酸氫二鈉配制，pH 6.0～8.0緩沖液用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配制。

2 結果與討論

2.1 不同鄰苯二酚濃度下PPO反應速率及Km值

由表1可知，都勻毛尖茶鮮葉PPO反應速率隨鄰苯二酚濃度增加而增大。采用雙倒數作圖法(圖1)，得到PPO酶活力的動力學方程式：1/v=0.0189×1/[S]+0.1328，R2=0.9803，根據米氏方程的倒數形式推導出Km/vmax=0.0189，1/vmax=0.1328，可以確定vmax值為7.5301 U·min-1，Km值為0.1423 mol·L-1。同一反應體系下的Km越大說明催化活力越低，越小則催化活力越高。

表1 不同鄰苯二酚濃度下都勻毛尖鮮葉PPO反應速率Table 1 The reaction rate of PPO in fresh leaves with different concentrations of catechol

圖1 鮮葉PPO催化鄰苯二酚的雙倒數曲線Fig.1 Double reciprocal plots of PPO in fresh leaves with catechol as substrate

2.2 溫度對PPO酶活力的影響

在20～70 ℃的溫度范圍內，測定PPO的活力，溫度對PPO活力的影響結果見圖 2。

圖2 溫度對PPO酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on PPO activity

由圖2可知，當溫度在20～30 ℃條件下，PPO活力隨著溫度的升高而上升，至30 ℃達到最高值；溫度高于30 ℃時PPO活力迅速下降，到達60 ℃時，PPO活力消失，這可能是由于PPO是一種蛋白質，不適宜的溫度會破壞PPO活性部位三維結構的完整性，而這種結構又是保持酶活力的關鍵因素[9]。適宜溫度范圍內酶催化反應速度隨溫度升高而加快，但超過某一溫度時蛋白質變性，酶活力消失。因此在利用都勻毛尖茶鮮葉加工紅茶過程中應選擇30 ℃左右的溫度發酵。

2.3 pH值對PPO酶活力的影響

在pH值為3.0～8.0的緩沖液中測定都勻毛尖茶鮮葉PPO粗酶的活性，pH值對PPO活力的影響結果見圖3。

圖3 pH值對PPO酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on PPO activity

由圖3可知，茶樹鮮葉PPO活力的最適pH值為4.0左右。當pH降為3.0時，PPO活力明顯降低；當pH從4.0逐漸增加到5.0時，PPO酶活力急劇下降。當pH大于7.5時酶活力又明顯上升，出現肩峰可能是由于茶葉存在多個多酚氧化酶同工酶引起的[10]，這些酶的最適pH會受到同工酶的數量、比例及性質的影響。在都勻紅茶加工過程中可以根據這一性質考慮一些相關措施，如使用檸檬酸等食用酸來調控pH值在3.5～4.5之間，促進酶的活力，縮短發酵時間。

3 結 論

關于pH對茶樹PPO活力影響的相關研究報道較多，但結果有所差異。研究顯示，茶樹品種福云6號[11]、櫧葉齊[12]、白毫早[13]、烏牛早和平陽特早[14]粗酶的最適pH分別為8.6、5.6、6.0、8.6。本研究發現都勻毛尖茶鮮葉PPO粗酶的最適反應pH為4.0，這與伍夢瑤等[15]測定勐庫大葉種PPO最適反應pH為4.4的結果較為相近。因此，不同茶樹PPO粗酶活性的最適pH差異可能與品種有關。紅茶發酵過程中葉片pH值逐漸降低而趨于酸性環境[16]，研究表明，偏酸性條件更利于紅茶重要品質成分茶黃素的形成且保持穩定[17]。因此，PPO最適pH偏酸性的都勻毛尖茶地方品種適宜作為紅茶加工的原料。發酵是紅茶品質特征成分轉化形成的關鍵工序，而PPO是茶多酚轉化為紅茶品質成分的關鍵酶[18]。PPO活性受發酵葉溫的調控，傳統紅茶生產中發酵葉溫一般為30 ℃左右[19]，采用先高溫(30 ℃左右)后低溫的發酵模式，有利于促進PPO酶活性的激活和后期活性的保持，促進初中級氧化產物的形成，充分發揮酶促氧化作用[18]。本研究表明，都勻毛尖茶PPO粗酶的最適反應溫度為30 ℃，而此條件下發酵有利于與紅茶品質呈正相關的茶黃素和茶紅素含量的累積[20-21]，為了更好地控制紅茶品質，盡量控制發酵在最適溫度下進行。本研究結果為都勻毛尖地方品種紅茶適制性研究提供參考。