453例胃癌患者胃黏膜幽門螺桿菌毒力相關基因分型及抗生素耐藥性分析▲

李倩倩 李偉之 饒秦文 吳育美

(1 西安醫學院附屬寶雞醫院胃腸鏡科，陜西省寶雞市 721006，電子郵箱：baolqianqian@163.com；2 西安交通大學第一附屬醫院消化內科，陜西省西安市 710061；3 陜西省寶雞市中心醫院消化科，寶雞市 721008)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)是定植于胃黏膜上皮細胞的革蘭陰性菌，Hp感染與多種胃腸疾病的發生有密切關系[1-2]。世界衛生組織/國際癌癥研究機構于1994年將Hp定為胃癌的Ⅰ類致癌原，也是當前唯一確定為Ⅰ類致癌原的細菌性病原微生物[3]。全球近一半人群存在HP感染情況，然而Hp相關的胃潰瘍、十二指腸潰瘍發病率卻遠不及其感染率高，且其患病類型多樣化[4]。微生物的血清型或基因型不同常會導致其感染與結局的差異，而病原菌的毒力是影響疾病程度的重要因素之一[5]。此外，細菌的抗生素耐藥現象也是當前Hp根除治療中所面臨的重要問題。由于Hp分離培養和藥敏實驗的開展相對比較困難，專家普遍建議通過了解當地的抗生素耐藥率來決定Hp的根除療法[6-7]。因此，本研究分析西安醫學院附屬寶雞醫院收治的453例胃癌患者Hp感染的情況，分析其毒力基因及分型，同時對Hp進行抗生素敏感性試驗，為了解該地區Hp對抗生素的耐藥性，以及臨床選擇治療方法提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月至2019年12月期間西安醫學院附屬寶雞醫院收治的453例胃癌患者作為研究對象，其中男性261例，女性192例，年齡58～73 (68.2±1.7)歲?；颊呔浳哥R病理活檢確診，且經13C呼氣試驗檢測均呈陽性，排除1個月內服用抗生素、鉍劑和質子泵抑制劑者。本研究經由我院倫理委員會批準，且所有患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 2.5 L微需氧產氣袋及密封培養盒(日本三菱化學株式會社，批號：9235ZJ-2)，阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星E-Test藥敏條均購自法國生物梅里埃公司(批號：412243、412315、412404、412393)，細菌基因組DNA提取試劑盒、Taq PCR MasterMix擴增試劑均購自北京天根生物技術有限公司(批號：OSR-M401)，PCR儀和凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司，Hp標準菌株NCTC11637來源于本院實驗室。

1.3 方法

1.3.1 Hp菌株的鑒定：取453例研究對象的胃黏膜組織標本，經全自動組織研磨儀充分研磨后制成組織勻漿，用無菌膠頭滴管將組織混懸液接種于Hp選擇性培養基(重慶龐通醫療器械有限公司)上，在厭氧條件下用凡士林封口密閉培養，5～7 d后觀察培養基上的菌落形態，挑選出疑似Hp的菌落(透明細砂或水滴樣，針尖大小，0.1～1 mm直徑)，革蘭染色后鏡檢，氧化酶、脲酶和觸酶試驗均呈陽性，可鑒定為Hp。本研究共獲得62株Hp臨床分離株，并于-80℃保存待檢。

1.3.2 Hp毒力相關基因分型檢測：本研究檢測的Hp毒力基因包括細胞毒素相關基因A(cytotoxin-associated gene A,CagA)、細胞空泡毒素A(vacuolating cytotoxin A, VacA)s1、VacAs2、VacAm1、VacAm2，參考相關文獻[8]對基因保守區域片段設計特異性引物，具體的特異性引物序列見表1所示。將凍存于-80℃的Hp臨床分離株在血平板中復蘇培養48 h，使用生理鹽水沖洗菌落后按照試劑盒說明書提取DNA。采用PCR進行Hp毒力基因的擴增和測序。PCR具體實驗參數和步驟為：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，52～60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共持續35個循環；72℃溫育5 min，4 ℃保存。必要時可對可疑條帶進行膠回收后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

表1 特異性引物序列

1.3.3 抗生素耐藥性試驗：將凍存于-80℃的Hp臨床分離株在血平板中復蘇培養48 h，將復蘇成功并傳代一次的菌株用0.45%氯化鈉溶液稀釋為2.0麥氏單位菌懸液，均勻涂布于M-Ⅱ血平皿中，并貼上阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星的E-test藥敏試條，于微需氧條件下培養3 d后觀察結果，于橢圓形抑菌環與E-Test試條交界點讀取最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)值。使用NCTC11637菌株作為質控菌株。

1.4 統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行統計學分析。計數資料以例數或百分率表示。

2 結 果

2.1 Hp毒力相關基因檢測結果 453例胃癌患者的胃黏膜標本中共分離出62例Hp臨床菌株，其中CagA檢出率為100.0%(62/62)，VacAs1a、VacAs1a+VacAm1、VacAs1a+VacAm2、VacAs1a+VacAs1c+VacAm2、VacAs1c+VacAm2和VacAm1+VacAm2檢出率依次為19.35%(12/62)、46.77%(29/62)、8.06%(5/62)、8.06%(5/62)、8.06%(5/62)、9.68%(6/62)，大多數患者同時攜帶多個亞型。

2.2 Hp抗生素耐藥性試驗 62株Hp臨床株，對阿莫西林的耐藥率最高，達到79.03%(49/62)，MIC范圍為0.016～32.000 mg/L；對克拉霉素的耐藥率為61.29%(38/62)，MIC范圍為0.016～256.000 mg/L；對甲硝唑的耐藥率為58.06%(36/62)，MIC范圍為0.016～125.000 mg/L；對左氧氟沙星的耐藥率為22.58%(14/62)，MIC范圍為0.008～32.000 mg/L；對四聯抗生素的耐藥率為20.97%(13/62)，MIC范圍為0.006～24.000 mg/L。

3 討 論

Hp感染率高而胃腸道疾病發病率低、發病表型多樣化的特點已逐漸引起學者們廣泛關注，但其具體機制仍未完全明確，一般認為Hp的毒力相關基因可能是其中一項原因。研究表明，Hp的主要毒力因子涉及黏附、炎癥、免疫等方面，包括CagA、VacA、上皮細胞接觸誘導因子(induced by contact with epithelium gene A,IceA)、前炎性外膜蛋白等[8]。本研究結果顯示，62例Hp臨床菌株中CagA檢出率占100.0%(62/62)，而VacAs1a、VacAs1a+VacAm1、VacAs1a+VacAm2、VacAs1a+VacAs1c+VacAm2、VacAs1c+VacAm2和VacAm1+VacAm2檢出率依次為19.35%、46.77%、8.06%、8.06%、8.06%、9.68%，說明大多數患者同時攜帶多個亞型。有學者認為，IceA基因的IcaA1亞型可能與胃潰瘍的發生密切相關[9]。VacA基因根據其S區、M區可分為2個等位基因，其中VacAs1m1較VacAs1m2具有較強的細胞毒性，而VacAs2m2無細胞毒性[10]。最近的研究也顯示VacAs1相關亞型與消化道炎癥有相關性，而VacAs2相關亞型并未發現相關性[11]。本研究未檢測到VacAs2亞型菌株，可能與本研究只納入胃癌患者及樣本量較少有關。

Hp感染盡管僅部分發生于消化道潰瘍、Hp相關消化不良、惡性腫瘤，但感染者幾乎都存在慢性活動性胃炎，即Hp胃炎。《第五次全國幽門螺桿菌感染處理共識報告》指出，對于Hp胃炎患者應采取根除療法，包括無癥狀患者[12]，而Hp的根除治療多根據區域內抗生素的耐藥情況而制定。本研究結果顯示，62株Hp臨床株中，對阿莫西林的耐藥率最高，達到79.03%，而對左氧氟沙星的耐藥率最低，為 22.58%?！兜谖宕稳珖拈T螺桿菌感染處理共識報告》推薦如果該區域內Hp對兩種抗生素的雙重耐藥率>39.3%，則不推薦含這兩種抗生素的非鉍劑四聯療法，提示該區域尚可使用含其他抗生素的方案，但仍需密切關注抗生素耐藥率的動態變化[12]。本研究中，Hp對四聯抗生素的耐藥率為20.97%，均低于4種抗生素單獨用藥的耐藥率，因此可考慮我國拓展的相關鉍劑四聯方案[質子泵抑制劑+鉍劑+阿莫西林+甲硝唑(或四環素)][12]。

綜上所述，我院胃癌患者胃黏膜Hp菌株毒力相關基因最常見為CagA基因，可使用耐藥性相對較低的左氧氟沙星或者抗生素四聯療法進行治療。Hp感染與疾病發生相關性的研究中，除需進一步了解毒力基因外，還應該考慮宿主易感性因素、基因多態性或者多因素分析(如社會經濟學、營養學等因素)可能產生的影響[13]，這也是我們下一步進行實驗探討的方向。