壯藥拔毒生肌膏對糖尿病大鼠創面愈合及表皮生長因子、血管內皮生長因子、溶菌酶表達水平的影響▲

周翠萍 張 力 江志雄

(1 廣西中醫藥大學第一臨床醫學院，南寧市 530001，電子郵箱：873072260@qq.com；2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院創面修復、周圍血管科， 南寧市 530012)

近年來，糖尿病已成為困擾全球的健康問題，其患者數量呈上升趨勢，雖不直接危害生命，但它嚴重影響患者的生活質量，已被納入中國慢性疾病譜，且在老年病中排名前十[1-2]。糖尿病潰瘍是其嚴重的并發癥之一，由于糖尿病潰瘍所致截肢的患者人數一直居高不下，已成為近年來學者研究的熱點。廣西中醫藥大學第一附屬醫院臨床上應用壯藥拔毒生肌膏治療糖尿病潰瘍、壓瘡、缺血性潰瘍等慢性難愈合創面取得良好效果，但其作用機制有待進一步研究。前期研究表明，壯藥拔毒生肌膏能夠促進大鼠氧化應激性創面愈合，并上調其表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及溶菌酶的表達[3]。在此基礎上，本研究采用腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)聯合背部打孔法建立糖尿病大鼠創面模型，24 h后用藥干預，光鏡下觀察創面組織病理情況并計算大鼠創面愈合率，同時檢測血清和組織中EGF、VEGF及血清溶菌酶水平變化情況，進一步研究壯藥拔毒生肌膏促進糖尿病創面愈合的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 壯藥拔毒生肌膏由宮粉、輕粉、硼砂、白芷、大黃、槐枝、白蠟、豬脂等按一定比例配制，由廣西中醫藥大學第一附屬醫院制劑科制備；重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠(貝復濟，珠海億勝生物制藥，批號：S20040001)。

1.2 實驗動物 健康雄性SD大鼠96只，無特定病原體級，體重(225±15)g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，合格證號：SCXK(湘)2014-0011。適應性飼養1周后開始實驗，所有實驗動物均取得廣西中醫藥大學倫理審查委員會審批。

1.3 實驗試劑及儀器 STZ(Sigma公司，貨號：S0130)，檸檬酸鈉緩沖液溶解，避光，冰浴，反復吹打至完全溶解為淡黃色澄清液體，現配現用；EGF、VEGF放射免疫試劑盒(北京華英生物，批號均為20180421)，溶菌酶測試盒(南京建成生物工程所，批號：AO50-1)，大鼠 EGF 酶聯免疫試劑盒(聯科生物工程研究所，批號：EK3831/2)，VEGF抗體試劑盒(武漢博士德，批號：BA0407)。低速離心機(上海安亭科學儀器廠，型號：TDL-80-2B)，輪轉式切片機(徠卡公司，型號：RM2235)，倒置顯微鏡和成像系統(日本尼康公司，型號：Nikon Ci-S、Nikon DS-U3)，脫水機和包埋機(武漢俊杰電子有限公司，型號：JT-12S、JB-P7)，全自動放免計數儀(西安核儀器廠，型號：XH-6020)，酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司，型號：Multiskan TC)，恒溫震蕩培養箱(Thermo Fisher Scientific公司，型號：ST70-2)，烤片機(常州國華電器有限公司，型號：DB-B2)。

1.4 分組及糖尿病大鼠模型的建立 按隨機數字法將大鼠分為假手術組、模型組、貝復濟組、拔毒生肌膏組，各24只。除假手術組外其余各組均腹腔注射STZ制作糖尿病大鼠模型[4]：誘導前禁食24 h，誘導時給予65 mg/kg STZ溶液腹腔注射，在30 min內完成注射，注射結束后更換墊料，1 h后喂食飼料。各組大鼠于注射前稱體重并測定血糖，注射后72 h每日測定體重、血糖，持續2周。注射前隨機血糖水平<8.9 mmol/L，注射后72 h隨機血糖水平≥16.7 mmol/L，即視為糖尿病模型誘導成功，若血糖不達標者，3 d后補注射20 mg/kg STZ溶液，再監測血糖情況。

1.5 糖尿病大鼠創面模型的建立及干預 糖尿病大鼠模型制備成功1周后，制備大鼠創面模型[3]。先用標記筆在大鼠背部畫出直徑約為1.8 cm的圓形創面，腹腔注射10%水合氯醛溶液(1.2 mL/L)，麻醉成功后采用組織剪沿標記筆筆記剪開皮膚組織，深至皮下，立即采用呋喃西林液清潔創面。根據創面大小將紗條剪成超出創面約0.5 cm小方塊紗條，24 h后拔毒生肌膏組創面外敷拔毒生肌膏紗條，貝復濟組創面外敷貝復濟浸透紗條，假手術組和模型組創面外敷生理鹽水紗條，最后各組均覆蓋兩層無菌干紗布，膠布固定，1次/d。持續干預12 d。

1.6 標本采集 藥物干預后 3 d、6 d 及12 d各組按隨機數字表法，分別取8只大鼠，10%水合氯醛溶液(大鼠30 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹腔動脈采血2 mL，靜置30 min后，3 000 r/min離心15 min，移液槍吸取上清液2 mL，放置-80℃冰箱待測。取血后采集相同位點創面組織，分成兩份，一份創面組織用4%多聚甲醛常溫固定，另一份組織置于凍存管，放置液氮中凍存待測。

1.7 檢測指標

1.7.1 創面愈合率：用標記筆在透明方格紙畫出各組大鼠創傷后24 h、3 d、6 d及12 d創面，以傷后24 h第一次畫的創面面積為創傷面積，以各時相點取材時的創面面積為時相點創面面積。采用ImageJ軟件計算創面面積。創面愈合率=[(創傷面積-時相點創面面積)/創傷面積]×100%[5]。

1.7.2 血清EGF、VEGF和溶菌酶的檢測：參照EGF、VEGF放射免疫試劑盒說明書，檢測血清EGF、VEGF的含量；根據溶菌酶試劑盒檢測步驟，采用比濁法檢測血清溶菌酶含量。

1.7.3 組織EGF和VEGF的檢測：參照各試劑盒說明書，采用酶聯免疫吸附法測定組織EGF表達；采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶檢測組織VEGF表達。VEGF結果的判讀：低倍鏡下尋找陽性表達較集中的地方(在血管內皮細胞胞漿中呈現棕黃色)，在400倍光鏡下隨機拍照3個視野，各計數100個細胞，結果采用半定量分析。首先對陽性強度進行評分，無表達為0分；弱陽性為血管內皮細胞胞漿內顆粒較細，顯色高于背景，評為1分；陽性為血管內皮細胞胞漿內顆粒細而多，顯色較明顯，評為2分；強陽性為胞漿內陽性顆粒粗而多，顯色明顯，評為3分。然后把弱陽性的細胞數乘1分，陽性細胞數乘2分，強陽性細胞數乘3分，計算平均每張切片陽性細胞VEGF表達的累計積分[6]。

1.7.4 創面組織的病理觀察：選擇合適部位取材組織厚度約3 mm，常規組織脫水、浸蠟，石蠟包埋，切片，烤片，脫蠟，高濃度梯度酒精脫蠟，蘇木精復染，鹽酸分化，氨水返藍，伊紅染色，低濃度酒精沖洗，吹干，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察創面組織生長情況(光學顯微鏡400倍)。

1.8 統計學分析 應用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，方差齊則組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊則采用秩和檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠創面愈合率 模型組干預后3 d及12 d的創面愈合率均低于假手術組(均P<0.05)。與模型組比較，貝復濟組干預后3 d及6 d的創面愈合率均升高，拔毒生肌膏組干預后6 d及12 d的創面愈合率均升高(均P<0.05)；且拔毒生肌膏組各時間點的創面愈合率與假手術組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，而貝復濟組干預后 12 d的創面愈合率低于假手術組和拔毒生肌膏組(均P<0.05)。見表1。

表1 不同時間點4組大鼠創面愈合率比較(x±s,%)

2.2 各組大鼠血清EGF和VEGF水平比較 (1)血清EGF水平：與假手術組比較，模型組干預后3 d的EGF水平降低(P<0.05)，貝復濟組和拔毒生肌膏干預后6 d及12 d EGF水平均升高(均P<0.05)，而其余時間點3組血清EGF水平與假手術組比較差異均無統計學意義(均P>0.05)；貝復濟組和拔毒生肌膏組各時間點血清EGF水平均高于模型組；拔毒生肌膏組干預后6 d的血清EGF水平低于貝復濟組(P<0.05)，而其余時間點兩組血清EGF水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。(2)血清VEGF水平：與假手術組比較，模型組干預后3 d、6 d的VEGF水平降低，貝復濟組干預后12 d的VEGF水平升高，拔毒生肌膏組干預后6 d VEGF水平降低(均P<0.05)，而其余時間點3組血清VEGF水平與假手術組比較差異均無統計學意義(均P>0.05)；貝復濟組各時間點的血清VEGF水平均高于模型組，而拔毒生肌膏組干預后6 d、12 d的血清VEGF水平均高于模型組(P<0.05)；各時間點，貝復濟組與拔毒生肌膏組的血清VEGF水平差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 不同時間點4組大鼠血清EGF、VEGF水平比較(x±s，ng/mL)

2.3 各組大鼠組織EGF、VEGF水平比較 (1)組織EGF水平：與假手術組比較，模型組干預后3 d的組織EGF水平升高，而干預后6 d及12 d組織EGF水平降低，貝復濟組、拔毒生肌膏組干預后3 d的組織EGF水平降低，而干預后12 d的組織EGF水平升高(均P<0.05)，其余時間點3組組織EGF水平與假手術組比較差異均無統計學意義(均P>0.05)；與模型組比較，貝復濟組、拔毒生肌膏組干預后3 d組織EGF水平降低，而其余時間點水平升高(均P<0.05)；各個時間點，貝復濟組與拔毒生肌膏組的組織EGF水平差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表3。(2) 組織VEGF水平:與假手術組比較，模型組干預后3 d及6 d組織VEGF水平降低，拔毒生肌膏組干預后3 d組織VEGF水平降低(均P<0.05)，其余時間點3組組織VEGF水平與假手術組比較差異均無統計學意義(均P>0.05)；各個時間點，貝復濟組與拔毒生肌膏組的組織VEGF水平均高于模型組(均P<0.05)，但兩組間組織VEGF水平差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表3。

表3 不同時間點4組大鼠組織EGF、VEGF水平比較(x±s，ng/mL)

2.4 各組大鼠血清溶菌酶水平比較 與假手術組比較，模型組干預后3 d、12 d血清溶菌酶水平降低，拔毒生肌膏組、貝復濟組干預后3 d的血清溶菌酶水平降低，而干預后6 d血清溶菌酶水平升高(均P<0.05)，其余時間點3組血清溶菌酶水平與假手術組比較差異均無統計學意義(均P>0.05)；各個時間點，貝復濟組與拔毒生肌膏組血清的溶菌酶水平均高于模型組(均P<0.05)，但兩組間差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表4。

表4 不同時間點4組大鼠血清溶菌酶水平比較(x±s，ng/mL)

2.5 各組大鼠創面組織病理變化 假手術組干預后3 d創面組織輕度水腫,痂下肉芽組織開始生成；干預后6 d創面組織水腫逐漸減輕，創面可見大量新生毛細血管,大量成纖維細胞整齊排列于創面；干預后12 d創面組織大部分已被鱗狀上皮覆蓋，痂下肉芽組織已成熟。模型組干預后3 d、6 d創面組織明顯水腫和出血,并化膿結痂，創面炎性反應較重，直到干預后12 d創面組織水腫和出血逐漸消失，但仍有白細胞滲出和淋巴細胞浸潤。貝復濟組干預后3 d創面炎性反應、組織水腫和出血明顯，痂下肉芽組織生長快于模型組；干預后6 d創面組織水腫和出血現象開始消失，成纖維細胞增多，新生毛細血管變多；干預后12 d創面組織一半已被鱗狀上皮覆蓋，痂下肉芽組織開始成熟。拔毒生肌膏組大鼠早期組織病理變化與貝復濟組相似，干預后3 d、6 d痂下肉芽組織生長較快，干預后6 d創面組織水腫和出血消失，成纖維細胞、新生毛細血管均增加；干預后12 d痂下可見逐漸成熟的肉芽組織，鱗狀上皮已覆蓋一半的創面組織。見圖1。

圖1 各組大鼠不同時相創面組織形態變化

3 討 論

糖尿病足潰瘍是糖尿病最嚴重且影響較大的并發癥之一[7]。有研究顯示，近3年來全球約有4.51億人罹患糖尿病,其中糖尿病足潰瘍患者約占15%[8]。糖尿病足潰瘍截肢率不斷上升，給患者自身的身心健康、生活、工作及家庭均帶來極大的影響[9]。隨著時代的發展進步，大多數人越來越追求肢體及軀體的完美性，而中醫藥外敷在糖尿病足潰瘍治療中具有簡、便、廉、驗的優勢[10]，有研究表明生肌玉紅膏、濕潤燒傷膏應用于糖尿病潰瘍效果顯著[3,11-12]，這讓多數患者克服了長期內服用藥及肢體缺失的恐懼感，為中藥外敷辨證治療慢性難愈性創面奠定了一定的基礎。壯藥拔毒生肌膏具有拔毒生肌、去瘀生新的功效，通過液化壞死組織，促進上皮爬行及新生肉芽組織生長[13]，給糖尿病足潰瘍等慢性難愈性創面患者帶來福音。

本研究結果顯示假手術組創面(非高糖狀態)愈合快速，而模型組干預后3 d及12 d的創面愈合率均低于假手術組，表明大鼠在高糖狀態下創面愈合緩慢，提示糖尿病是抑制創面愈合的重要因素。貝復濟在臨床上常用于治療壓瘡、燒傷等創面，能加快上皮細胞爬行，促進創面愈合效果顯著[14-15]，故本研究將其作為對照組藥物。本研究中拔毒生肌膏組、貝復濟組的糖尿病模型大鼠創面組織水腫和出血較早消失，肉芽組織較快生長，在干預后12 d兩組大鼠創面痂下肉芽組織已開始成熟，創面組織超過半數被鱗狀上皮覆蓋，而模型組創面組織仍有白細胞滲出和淋巴細胞浸潤，創面水腫和出血慢慢消失；同時，與模型組比較，貝復濟組干預后3 d及6 d的創面愈合率均升高，拔毒生肌膏組干預后6 d及12 d的創面愈合率均升高(均P<0.05)。這提示拔毒生肌膏和貝復濟能夠加速糖尿病合并創面愈合，均是治療糖尿病合并創面愈合的有效藥物。但拔毒生肌膏組各時間點的創面率與假手術組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，而貝復濟組干預后12 d的創面愈合率低于假手術組和拔毒生肌膏組(均P<0.05)，即拔毒生肌膏在后期促進創面愈合速度加快，提示拔毒生肌膏的作用優于貝復濟。

創面修復由止血期、炎癥反應期、增殖性修復期和傷口重塑4個過程組成。愈合過程中EGF是促進創面愈合的生長因子[15]，其主要在創面愈合中后期促進創面再上皮化，同時在炎癥階段也能促進各種細胞的增殖遷移[16]；此外，VEGF亦是較為重要的促進創面愈合的生長因子[18-21]，其只作用于血管內皮細胞，促進血管生成。溶菌酶具有殺菌抗炎作用，能夠促進組織修復及提高免疫力[22]，其表達上調有利于創面愈合[23]。有研究顯示，給予溶菌酶-抗菌肽融合蛋白作用于糖尿病創面，利于創面修復及肉芽組織中的血管生成，降低促炎因子的水平[24]。本研究中，干預后6 d、12 d貝復濟組、拔毒生肌膏組血清及組織EGF、VEGF水平均高于模型組；各個時間點貝復濟組與拔毒生肌膏組的血清溶菌酶水平均高于模型組(均P<0.05)。這提示貝復濟及拔毒生肌膏均能上調糖尿病大鼠血清及創面組織EGF、VEGF的表達，以及血清溶菌酶水平，從而加快創面愈合。

本研究中，拔毒生肌膏在創面愈合后期的作用優于貝復濟，然而除干預后6 d拔毒生肌膏組的血清EGF水平低于貝復濟組外，貝復濟組、拔毒生肌膏組其余時間點血清EGF水平，以及各個時間點組織EGF和VEGF、血清溶菌酶水平均無明顯差異(P>0.05)，這表明貝復濟、拔毒生肌膏促進EGF、VEGF表達的能力相當。貝復濟本質是成纖維細胞因子，作用靶點明確；而拔毒生肌膏的分子作用機制不明，其可能通過多靶點，多信號通路調控創面愈合，其作用機制有待進一步探索及研究。

綜上所述，壯藥拔毒生肌膏通過調控血清和組織EGF、VEGF及血清溶菌酶表達，改善糖尿病大鼠創面肉芽水腫，加快創面組織上皮爬行，進而促進創面愈合，且其在后期促進創面愈合的作用優于貝復濟，這為臨床中藥外用于糖尿病創面提供有用的實驗數據。目前，對于壯藥拔毒生肌膏分子生物學的研究仍較少，僅局限于臨床觀察，其促進創面愈合的相關通路及多靶點的研究有待進一步明確。