染色體微陣列分析在胎兒顱內結構異常產前診斷中的應用

寧舒婷 張海英 耿國興 王映飛 黃而弘 李敏清

(廣西壯族自治區江濱醫院 1 婦產科，2 B超科，南寧市 530021，電子郵箱：810104953@qq.com；廣西壯族自治區婦幼保健院 3 遺傳代謝中心，4 放射科， 南寧市 530002；5 廣西醫科大學第一附屬醫院產前診斷與遺傳病診斷科，南寧市 530021)

隨著我國女性初次生育年齡逐漸增大及二胎政策的全面實施，出生缺陷率呈逐年上升趨勢[1]。神經系統畸形是胎兒時期較常見的先天異常，患病率為0.14%～0.16%[2]。神經系統畸形包括顱內結構異常與脊柱結構異常，其中顱內結構異常是神經系統畸形的主要類型，種類較多，包括神經管缺陷(無腦畸形、露腦畸形、腦膨出及腦膜膨出)、腦積水和腦室擴張、胼胝體發育不全、Dandy-Walker綜合征、前腦無裂畸形、脈絡叢囊腫等。

研究表明，胎兒神經系統結構異常與染色體病(數目異常和結構畸變)關系密切，尤其是18-三體和13-三體[3]。在過去40年里，胎兒神經系統畸形的遺傳學產前診斷方法主要是經典的顯帶核型分析。然而，傳統的顯帶核型分析不能發現小于5 Mb的染色體異常，不能識別染色體微缺失和微重復。Hultén等[4]研究發現，傳統的染色體核型分析只能檢出15%～40%的染色體異常。在臨床中，我們也時常發現傳統的染色體核型分析未發現異常的胎兒結構畸形病例，往往隱藏著亞顯微基因組拷貝數變異(copy number variation，CNV)，而微缺失和微重復變化常與胎兒發育異常相關。近年來新興發展的高分辨率染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis，CMA)，通過對基因組CNV的檢測分析，可檢出50～100 kb的CNV，并能識別常規染色體核型分析不能發現的微缺失或微重復，額外發現6%～15%的染色體細微變異，對染色體亞微結構異常進行診斷，突破了傳統核型分析的技術局限性。此外，CMA無須組織或細胞培養，可避免母體污染，檢測所需時間短，是分子細胞遺傳學技術的革命性發展[5]。CMA檢測能顯著提升染色體疾病檢出能力[5-8]，實現產前診斷的精確化，在以胎兒超聲異常為主的產前診斷中有著重要的臨床意義。目前，CMA單獨應用于胎兒顱內結構異常診斷的大數據研究罕見報告。因此，本研究對121例超聲診斷存在胎兒顱內結構異常的病例進行回顧性分析，比較其染色體核型分析及CMA的檢測結果，探討產前CMA在胎兒顱內結構異常產前診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月至2018年7月在廣西壯族自治區婦幼保健院產科門診或優生遺傳科就診的121例胎兒顱內結構異常病例，回顧性分析其臨床資料。納入標準：孕期胎兒超聲檢查發現胎兒顱內結構異常。排除標準：(1)胎兒存在脊柱結構異常；(2)孕婦認知功能障礙；(3)孕婦隨訪不確定者。孕婦年齡17～44歲，孕周17～34周。

1.2 超聲檢查方法 使用日本東芝Aplio 400型彩色多普勒超聲診斷儀，二維凸陣探頭頻率為3.5～5.0 MHz。受檢孕婦取仰臥位，超聲檢查切面包括:丘腦、側腦室、小腦切面，脊柱縱切面，鼻骨矢狀正中切面，眶間距切面，顏面冠狀切面，四腔心、左右心室流出道觀、三血管觀，主動脈弓切面、導管弓切面，腹圍切面，膀胱旁臍動脈切面，雙腎橫切面及縱切面，雙上肢肱骨、尺橈骨、雙下肢股骨、脛腓骨縱切面等。同時觀察羊水、臍帶及胎盤情況。

1.3 G顯帶核型分析及CMA檢測方法

1.3.1 取材：孕婦充分知情并簽署同意書，經排除手術禁忌證后獲取胎兒細胞。其中，孕17～22周孕婦選擇經腹羊膜腔穿刺術獲取羊水，孕周>22周者選擇經皮臍靜脈穿刺術獲取臍血標本。獲取的標本均分為兩份。

1.3.2 染色體核型分析方法：取其中一份標本制備染色體。其中羊水標本以1 500 r/min離心8 min，棄上清液。因雙人雙線培養，沉淀物被分為2份，同時接種于美國Irvine Scientific公司和廣州白云山拜迪生物醫藥公司生產的兩種羊水細胞培養基中，置于37℃、5% CO2培養箱中培養7～10 d；在Olympus CKX31倒置顯微鏡(日本Olympus 公司)下觀察細胞生長情況，待細胞貼壁并生長至7～8個較大克隆時，加秋水仙素終止細胞與分裂中期，采用胰酶消化法收獲培養的羊水細胞，1 800r/min離心8 min收獲細胞沉淀。臍血標本送實驗室后，也需雙人雙線培養，標本分別接種于廣州達暉生物醫藥公司和廣州白云山拜迪生物醫藥公司生產的2種淋巴細胞培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養68～72 h后，加秋水仙素終止細胞于分裂中期，1 800 r/min離心8 min收獲臍帶血細胞沉淀。對羊水或臍帶血細胞沉淀依次行固定3次[用0.075%氯化鉀、3 ∶1(甲醇 ∶乙酸)的固定劑]、滴片、顯帶、染色，然后采用G顯帶核型分析技術，均采用德國蔡司染色體分析軟件進行核型分析，常規計數20個核分裂象，分析其中5個核型。若發現異常嵌合體核型，則將計數與分析增加至50個核分裂象。根據2013版《人類細胞遺傳學國際命名體制》(ISCN2013)[9]，對檢出的染色體核型進行命名。

1.3.3 CMA方法：取另一份標本，采用廈門致善生物科技有限公司生產的Lab-Aid 820核酸提取Midi試劑盒(批號：200116)，按試劑盒說明書進行DNA提取，DNA質檢操作標準根據Human Cyto SNP-12 300K微陣列芯片(美國Illumina公司)操作手冊執行。檢測流程包括DNA定量，全基因組擴增，DNA片段化，沉淀、重懸DNA片段，DNA與芯片雜交，芯片清洗，單堿基延伸及染色，包被芯片。用Illumina iScan激光共聚焦掃描儀對雜交后的芯片進行掃描，數據結果使用KaryoStudioV1.4.3.0軟件進行分析。查閱常用數據庫[Clingene(https：//www.clinicalgenome.org)、ClinVar(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)、DECIPHER(https：//decipher.sanger.ac.uk)、DGV(http：//dgv.tcag.ca/dgv/app/home)和OMIM(http：//omim.org)等]及PubMed數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)，對檢出異常CNV及嵌合情況進行分析。CNV的致病性按美國醫學遺傳學與基因組學學會制定的相關致病性判讀指南[10]進行判讀。

1.4 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計數資料以例數(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 121例顱內結構異常胎兒的染色體核型分析結果 121例顱內結構異常的胎兒中，核型正常 110例，占90.9%；染色體核型異常11例，檢出率為9.1%，其中致病性染色體異常(非整倍體異常、非平衡性結構異常核型)7例(5.8%)。在11例染色體核型異常的病例中，染色體數目異常共 4例(21-三體綜合征1例、18-三體綜合征1例、胎兒標記染色體1例、9號染色體短臂四體并性染色體嵌合異常1例)，染色體結構異常共7例(平衡易位1例、臂間倒位2例、大片段缺失2例、大片段重復2 例)，見表1。

表1 11例染色體異常胎兒的顱內結構異常表現、CMA結果及臨床結局

2.2 顱內結構異常胎兒的CMA結果 121例胎兒中，26例檢出CNV，檢出率為21.5%，其中致病性CNV共15例，檢出率為 12.4%，意義不明確的變異(variants of unknown significance，VOUS)共 11例，檢出率為9.1%。CMA對致病性CNV的檢出率(12.4%)與染色體核型分析的致病性染色體檢出率(5.8%)比較，差異無統計學意義(χ2=2.450，P=0.118)，但針對致病性染色體異常，CMA較傳統的核型分析額外增加了6.6%的檢出率。

15例致病性CNV中，非整倍體染色體異常3例，均與染色體核型G顯帶結果一致；染色體大片段缺失1例，染色體核型分析提示46，XN,del(5)(p14)；部分缺失部分重復1例，染色體核型分析提示46，XN,del(18)(q22q23)；染色體大片段重復2例，染色體核型分析分別為46，XX,der(2)t(2;7)(q37;q22)和46，XN，der(7)t(2；7)(p23；q35)；微缺失微重復8例，染色體核型分析均正常。見表2。

表2 15例致病性CNV胎兒的CMA及染色體核型檢測結果、顱內結構異常表現、臨床結局

15例致病性CNV中，7例為明確的微缺失/微重復綜合征及致病性綜合征，分別是貓叫綜合征、16p13.11微缺失綜合征、Wolf-Hirschhorn綜合征、Smith-Magenis綜合征、21-三體綜合征、18-三體綜合征,1q21.1微缺失綜合征;其余8例所包含的致病性 CNV，在DECIPHER 數據庫中已有較多變異報告，并存在臨床表型及導致神經系統畸形的致病基因。15例致病性CNV經隨訪，均通過引產終止妊娠。

3 討 論

染色體亞顯微層面結構異常引發的出生缺陷，臨床表型的嚴重性不亞于染色體顯微層面上數目或者結構異常，而CMA技術的革命性發展，為檢測這種亞顯微染色體異常提供了一種新方法。Wapner等[5]研究發現，應用CMA 進行檢測可以較常規核型分析多發現6%的病理意義拷貝。 Sun等[11]對46例胎兒神經系統發育異常但染色體核型分析正常的孕婦進一步行 CMA檢測，發現在37.0%的病例中檢測到 CNV，10.9%的胎兒有致病性 CNV。此外，有研究表明，在染色體核型分析判定為平衡易位樣本中，有7.9%的樣本在斷裂連接處存在CNV[12]。因此，應用 CMA 技術可同時了解遺傳物質數量是否發生增減，為胎兒去留的選擇提供重要依據[12]。

本研究中，采用CMA共檢出致病性CNV 15例(檢出率為12.4%)，其中7例為明確的微缺失/微重復綜合征及致病性綜合征，8例所包含的致病性 CNV存在臨床表型及導致神經系統畸形的致病基因，經隨訪均通過引產終止妊娠。而染色體核型分析檢出核型異常11例(檢出率為9.1%)，其中致病性染色體異常(非整倍體異常、非平衡性結構異常核型)僅7例(5.8%)。雖然兩種技術的致病性染色體異常檢出率差異無統計學意義(P>0.05)，但針對致病性染色體異常，CMA仍較傳統的染色體核型分析額外增加了6.6%的檢出率，CMA檢出的8例微缺失/微重復，其染色體核型分析均正常。額外發現的這8例致病性CNV，如果只進行傳統的核型分析，有可能會因為所謂的“金標準”無異常選擇繼續妊娠，在后續的檢查發現更嚴重的異常而影響臨床干預時機。由此可見，針對影像學檢查提示胎兒顱內結構異常的孕婦，即使傳統核型分析提示結果正常，行CMA分析也是必要的，其可為評估胎兒預后提供更多信息，有利于遺傳咨詢及再發風險的評估，并可進一步減少活產兒嚴重出生缺陷的發生。此外，在本研究的11例提示染色體異常的胎兒中，有1例胎兒標記染色體CMA未檢出異常，隨訪時孕婦拒接電話，胎兒結局失訪，3例為平衡易位的胎兒CMA 結果均未見異常，隨訪均正常分娩，嬰兒生長發育正常。由此可見，染色體核型異常的胎兒，由于遺傳物質數量未發生增減，微陣列芯片結果可正常，這對于胎兒去留的選擇有著重要的參考意義。然而，微陣列技術也存在局限性，其不能檢測出拷貝數沒有變化的染色體異常，如染色體平衡性結構改變(相互易位、倒位、插入)，而此類染色體物質的平衡與重排對目前妊娠雖沒有影響，卻與未來的生殖咨詢有關。

總之，對存在顱內結構異常的胎兒，CMA較傳統核型分析可提供更多臨床信息，對胎兒結局的評估有著重要意義。故當產前檢查發現胎兒顱內結構異常時，應產前同時行染色體核型分析及CMA分析。