磷酸二酯酶4各亞型mRNA在特應性皮炎及銀屑病皮損中的表達水平及其在發病機制中的作用▲

羅 浩 吳志洪 鐘 江 張 衍 陳 娜

(廣西中醫藥大學第一附屬醫院皮膚科，南寧市 530023，電子郵箱：luohao1943@163.com)

磷酸二酯酶4(phosphodiesterase 4,PDE4)由4個基因編碼，分別為PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D，因其能特異性水解，使細胞內環腺苷酸濃度區域化，對下行信號傳導及各種細胞功能具有重要調控作用，可作為多種炎癥性疾病的潛在治療靶點，如哮喘、慢性阻塞性肺疾病、銀屑病及克羅恩病等[1-3]。本研究通過檢測特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)及銀屑病皮損中PDE4各亞型mRNA的表達情況，探討其在AD和銀屑病的發病機制中的作用。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選取2017年11月至2018年9月于我院皮膚科門診就診的AD患者21例(AD組)，銀屑病患者19例(銀屑病組)及于我院激光美容科手術切除皮膚組織(未見病理改變)的患者15例(對照組)。AD診斷符合Williams診斷標準[4]，銀屑病診斷符合尋常性銀屑病的診斷標準[5]。所有研究對象近2個月內未使用抗組胺藥物、類固醇皮質激素、免疫調節劑等藥物，均排除心、腦、肺、腎臟器疾病及高血壓等疾患。AD組男性8例，女性13例，年齡(34.85±11.43)歲；銀屑病組男性12例，女性7例，年齡(37.62±13.37)歲；對照組男性4例，女性11例，年齡(35.51±10.29)歲。3組患者的性別、年齡差異均無統計學意義(均P>0.05)。本研究經我院倫理委員會批準，所有研究對象均對本研究知情了解并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 實驗試劑與儀器：TRIzol購于美國Thermo公司(批號：15596-026)，反轉錄試劑盒購于美國Thermo Fisher公司(批號：K1622)，定量PCR檢測試劑盒購于QIAGEN公司(批號：208054)，RNA酶抑制劑購于ABI公司(批號：N8080119)，DNA酶購于NEB公司(批號：M0303S)，瓊脂糖(批號：A610013-0250)購于上海生工公司,熒光定量PCR儀購于ABI公司(型號：7500)。

1.2.2 引物的設計與合成：從GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)中檢索下載PDE4各基因亞型的核苷酸序列，用Primer 5.0引物設計軟件在保守區域進行特異性上、下游引物的設計，見表1。引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 熒光定量PCR引物基因序列

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測PDE4各亞型相對表達水平：門診行病理活檢時取部分皮膚組織(以四肢皮損為主)，直徑約3～4 mm。皮損標本采集后置于液氮速凍，-80℃超低溫冰箱中保存備用。將凍存的皮損標本進行液氮研磨，加入1 mL TRIzol使其裂解充分后加入200 μL氯仿，用力搖15 s，靜置5 min。4℃下12 000 r/min離心15 min。小心吸取上層水相，加入等量異丙醇混勻，靜置10 min。4℃下12 000 r/min離心10 min，棄上清。加入1 mL 75%乙醇，使沉淀懸浮，4℃下12 000 r/min離心10 min，棄上清。干燥沉淀5 min，加入20 μL經焦碳酸二乙酯處理并經高溫高壓消毒的超純水。去DNA操作：從離心管中取出上述液體2 μL，加入DNA酶0.2 μL、緩沖液1 μL、RNA酶抑制劑0.3 μL，加去酶水至10 μL，輕混勻，37℃溫育30 min,75℃熱變性10 min。反轉錄：使用反轉錄試劑盒將RNA樣本逆轉錄為cDNA，反應條件為37℃ 15 min，98℃ 5 min，使酶失活后置于冰上。將逆轉錄好的cDNA稀釋10倍后行PCR檢測，反應體系：2×濃縮的實時定量PCR擴增的預混液5 μL，引物A 0.5 μL，引物B 0.5 μL，熒光染料ROX 0.05 μL，模板cDNA 1 μL，無酶水2.95 μL，總體積10 μL。反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環。根據所得的Ct值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內參照，△Ct=(目的基因Ct-內參基因Ct)，△△Ct=各樣品ΔCt值-空白組ΔCt平均值；2-ΔΔCt計算PDE4各亞型的相對表達水平。

1.3 統計學分析 應用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，方差齊時，多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊時，多組間和兩兩比較采用秩和檢驗；計數資料以例數或百分比表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

3組患者的PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D mRNA的相對表達水平比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。其中，AD組患者的PDE4B、PDE4D mRNA相對表達水平高于對照組(P<0.05)，而PDE4A、PDE4C mRNA相對表達水平與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；銀屑病組患者的PDE4A、PDE4D mRNA相對表達水平高于對照組(P<0.05)，而PDE4B、PDE4C mRNA相對表達水平與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；AD組與銀屑病組中，AD組患者皮損中PDE4B mRNA相對表達水平呈特異性高表達，銀屑病組患者皮損中PDE4A mRNA相對表達水平呈特異性高表達(P<0.05)。見表2。

表2 3組PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D mRNA的相對表達水平(x±s)

3 討 論

PDE4屬于磷酸二酯酶的重要亞型之一，主要存在于嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和CD4+淋巴細胞中[6]。PDE4家族由PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D這4個類似基因編碼的20多個亞型組成，作為PDE家族中水解環腺苷酸的一個最大群體，在環腺苷酸信號通路中占有重要地位。環腺苷酸作為細胞內的第二信使，它的信號傳遞過程是通過環腺苷酸空間降解后形成細胞內濃度差異，隨后細胞內環腺苷酸與環腺苷酸效應分子(如蛋白激酶A和環腺苷酸直接激活的交換蛋白Epac)結合，調節不同的細胞過程[7]。PDE4通過水解環腺苷酸，可以控制多種細胞反應，在哮喘、慢性阻塞性肺疾病、中樞神經系統疾病、銀屑病等疾病中發揮重要作用[6,8]。然而，PDE4各亞型的功能作用尚未得到證實，目前國內外對PDE4各亞型的研究多集中在神經系統領域。Pérez-Torres等[9]對人腦組織進行原位雜交免疫組化分析發現，PDE4A、PDE4B、PDE4D廣泛分布在大腦皮層、海馬、腦干、丘腦和基底細胞節等結構中，且在大腦不同結構中的分布不同，PDE4C只局限地分布在皮層、小腦、丘腦等，這種分布差異表明PDE4各亞型可能具有不同的作用。Barber等[10]的研究結果顯示，與健康人相比，慢性阻塞性肺疾病患者血液單核細胞和中性粒細胞中的PDE4A、PDE4B和PDE4D的轉錄水平明顯增高，PDE4C轉錄水平低于PDE4其他亞型的轉錄水平。Landells等[11]的研究證實，除PDE4C外，PDE4A、PDE4B和PDE4D在正常人和哮喘患者的CD4+和CD8+T淋巴細胞中大量存在。這些研究表明，在多種免疫細胞中(如嗜堿性細胞、嗜酸性細胞、T細胞及單核細胞等)的PDE4可能以PDE4A、PDE4B和PDE4D這3個亞型為主。

Schafer等[8]通過檢測PDE4亞型在銀屑病外周血單核細胞及皮損中的分布情況，并評估成纖維細胞中PDE4/CD271復合物的功能，發現銀屑病患者外周血單核細胞中PDE4B及PDE4D mRNA表達水平較健康人群升高，在銀屑病病灶皮膚組織中，特別是內皮細胞與成纖維細胞中，PDE4A及PDE4D mRNA的表達增加，表明PDE4及PDE4/CD271復合物在銀屑病成纖維細胞的功能調節中起重要作用。本研究結果顯示，銀屑病組患者皮損中PDE4A、PDE4D mRNA相對表達水平高于對照組(P<0.05)，這與Schafer等[8]的研究結果相似。Huston等[12]研究證實PDE4A5基因的過表達可以保護成纖維細胞免受細胞凋亡。而成纖維細胞表型和功能的改變在銀屑病的發生發展過程中起重要作用[13-14]。本研究中，銀屑病皮損中PDE4A及PDE4D mRNA相對表達水平增高可能是阻止成纖維細胞凋亡，進而控制細胞的過度增生，維持表皮增生與凋亡動態平衡的一個保護性變化。

目前，皮膚屏障功能障礙是AD發病的首要機制。AD表皮的脂肪酸、膽固醇及神經酰胺的合成減少，會導致角質層的水分減少和皮膚屏障功能降低。皮膚的屏障功能還與皮膚炎癥有密切關系，當皮膚屏障功能受損時，大量免疫細胞如巨噬細胞、單核細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、樹突狀細胞等的聚集和浸潤會促使多種促炎介質釋放，從而導致皮膚炎癥反應[15]。而PDE4B作為PDE4炎癥調控的主要亞型，在激活腫瘤壞死因子α反應中起著至關重要的作用，研究顯示，PDE4B缺陷小鼠在脂多糖刺激后出現PDE4B mRNA表達增高，PDE4活性增加，腫瘤壞死因子α分泌減少[16]，表明脂多糖激活PDE4B基因從而刺激腫瘤壞死因子α的分泌是構成有效免疫反應所必需的調節過程。國外多項研究發現PDE4D與整合素5結合可以減弱環腺苷酸/蛋白激酶A信號傳導，激活內皮細胞炎癥反應，且小鼠體內敲除PDE4D后，動脈粥樣硬化易發部位的炎癥反應減弱，表明整合素5與PDE4D的相互作用可能與細胞外基質的重塑及炎癥密切相關[17-19]。PDE4B和PDE4D不僅具有重要的抗炎作用，其在脂肪代謝、蛋白質合成中也起重要作用。研究顯示，脂肪細胞中PDE3B和PDE4D的過表達可導致基礎脂解率降低及胰島素誘導的脂解抑制作用增強，進而導致糖尿病代謝調節改變[20]。Avila等[21]發現，酒精能夠誘導肝臟PDE4尤其是PDE4B的表達增加，阻斷環腺苷酸信號傳導，肝臟細胞更易發生脂肪酸氧化損傷和脂肪變性。本研究中，AD組患者皮損組織中的PDE4B、PDE4D mRNA相對表達水平高于對照組(P<0.05)，因此我們推測AD組中PDE4B及PDE4D mRNA相對表達水平特異性增高可能涉及表皮炎癥和脂質代謝過程。此外，AD組和銀屑病組相比，AD組患者皮損組織中的PDE4B mRNA相對表達水平呈特異性高表達，銀屑病組患者皮損組織中的PDE4A mRNA相對表達水平呈特異性高表達(P<0.05)，提示PDE4A與細胞的增殖和凋亡密切相關，PDE4B與細胞炎癥和脂質代謝密切相關；而PDE4D在AD組與銀屑病組中的表達都明顯增高，提示PDE4D可能在調控表皮細胞增殖和炎癥反應中都發揮一定作用。

綜上所述，PDE4各亞型mRNA在AD及銀屑病皮損組織中的表達水平呈差異性，這種差異性表達可能在AD和銀屑病的發生及病情演變過程中發揮重要作用。目前已有多種PDE4抑制劑進入臨床實驗階段，但由于部分患者出現惡心、嘔吐等副反應而被迫中止使用，而針對PDE4亞型的特異性抑制劑可能可以減輕或消除PDE4抑制劑的副反應，具有廣闊的市場前景。