Tween 20與蛋白質相互作用后對乳液物理及氧化穩定性的影響

張泰毓，何姍，張雨晴，王寧，黃國，隋曉楠，江連洲

(東北農業大學 食品學院，黑龍江 哈爾濱，150030)

大豆分離蛋白(soy protein isolate, SPI)是一種高營養的植物蛋白，具有無色無味、易于消化、含有豐富的氨基酸等特點。以SPI穩定的水包油乳液，會在油滴表面吸附上一層蛋白，形成相對穩定的界面蛋白保護膜，從而能夠降低體系的界面張力，進而使乳液達到相對穩定狀態[1]。

Tween 20是一種非離子型多聚乙醚類低分子表面活性劑，具有增溶、乳化和穩定等功能，同時具有價格低廉、化學性穩定和無毒等優點。Tween 20與蛋白質的相互作用研究受到了廣泛關注。蛋白-低分子表面活性劑混合物的界面或乳化特性方面通常存在協同或對抗的作用[2]。

水包油(oil in water, O/W)乳液是油脂存在于食品中相對常見的分散體系，在食品應用中蛋白質和小分子表面活性劑一般共存。早期乳液的利用體現在乳制品，如牛奶和酸奶等。在化妝品領域也應用廣泛，所有的護膚霜和潤膚露等都是乳液。SPI和Tween 20是2種重要類型的乳化劑。Tween 20能形成比SPI大一些的界面壓，因而具有更小的界面張力。隨著Tween 20濃度的增大，吸附在界面上的SPI會逐漸被Tween 20置換，進入水相，最終形成小分子吸附層，該過程稱為界面取代過程[3]。

關于含有Tween 20乳液體系的研究已有一些報道[4-5]，小分子表面活性劑在乳液中的應用逐漸成為研究人員關注的熱點。ARANCIBIA等[6]研究表明，Tween 80比卵磷脂更有效，可用于開發具有良好物理性能的天然納米乳劑。KALTSA等[7]研究了Tween 20將乳清分離蛋白置換后，界面上發生的一些特性變化，乳液粒徑隨Tween 20的增大而減小。CAI等[8]研究表明，小分子表面活性劑形成的界面膜的黏彈性較差，含有蛋白的膠體系統通常更穩定。楊力會等[9]研究了Tween 20添加量為 0.005% 時，可使油脂氧化相對緩慢；當Tween 20含量增加到 0.01%～0.20%時，在一定程度上會起到促進氧化的效果。

本研究旨在對SPI與Tween 20 的乳液體系的物理及氧化穩定性進行探討，以期為制備含Tween 20的蛋白質乳液提供技術支撐，也為O/W乳液體系的物理及氧化特性研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆，市售；低溫脫脂豆粕，實驗室自制；大豆分離蛋白，實驗室自制；核桃油，吉林省姜炳堂商貿有限公司；牛血清白蛋白、Tween 20，美國Sigma 試劑公司；2，4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH)，阿拉丁試劑上海有限公司；2-硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid， TBA)，上海展云化工有限公司；HCl、NaOH等試劑為分析純級。

1.2 儀器與設備

IKA T18 digital ULTRA TURRAX粗均機,德國艾卡公司; Mastersizer 2 000 Nano-ZS90激光粒度儀,英國馬爾文儀器有限公司; FD5-3 型冷凍干燥機,美國 SIM 公司；Tecan Infinite 200 Pro 酶標儀,瑞士帝肯公司；KjelFlex K-360凱氏定氮儀,上海纖檢儀器有限公司；高壓均質機,鞏義市予華儀器有限責任公司；XG-CAM系列接觸角測量儀,上海軒鐵創析工業設備有限公司;RF-6000熒光分光光度計，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備

參考 HUANG等[10]的方法稍作修改，將粉碎后的大豆粉用正己烷脫脂3次(1 g大豆粉用3 mL正己烷脫脂)，并將脫脂豆粉放置于通風櫥內進行干燥，去除易揮發的正己烷。用蒸餾水將得到的粉末按照1∶15(g∶mL)進行溶解，用2 mol/L NaOH將溶液pH 調節到8.0，并在室溫下進行磁力攪拌2 h。將混合液在4 ℃下14 000 r/min離心15 min，收集上清液。用2 mol/L HCl調節上清液pH至4.5，隨后進行離心15 min(4 ℃，4 000 r/min)。棄上清液，將沉淀物從離心筒中取出并溶解在裝有蒸餾水的燒杯中，用蒸餾水將沉淀物反復洗滌3次，用2 mol/L NaOH將pH值調至中性，倒入玻璃培養皿中放入冰箱冷凍層。之后用凍干機凍干，進行研磨，最后得到大豆分離蛋白粉末。并由凱氏定氮方法測得 SPI 的蛋白質量分數為(91.3±0．60)% (N×5.71)。

1.3.2 大豆分離蛋白乳液的制備

稱取一定質量的SPI 粉末并在磷酸鹽緩沖液(phosphate bulfer saline, PBS)(5 mmol/L，pH 7)中溶解，在室溫下低速攪拌3 h至充分溶解，隨后放入冰箱水化過夜，得到質量分數為 1%的蛋白溶液作為水相備用。將50 g/L核桃油與950 g/L水化好的蛋白質溶液通過3次粗均(10 000 r/min，1 min)后制備出粗乳液。然后將粗乳液用高壓均質機循環均質3次(8～35 MPa)，最終得到乳液樣品。整個過程在冰水浴下進行，防止高溫引起SPI變性。制備得到4種乳液樣品分別為：10 g/L SPI(SPI);10 g/L SPI+5 g/L Tween 20(SPI+T5);10 g/L SPI+10 g/L Tween 20(SPI+T10);10 g/L Tween 20(T10)的乳液樣品。在所有乳液樣品中加入0.2 g/L疊氮化鈉抑制微生物生長[11]。取部分乳液作為新鮮乳液置于冰箱存放，將剩余乳液分裝在帶蓋玻璃瓶中。乳液在50 ℃黑暗中保持6 d，收集樣品定期進行氧化實驗[12]。

1.3.3 乳液粒度和粒徑分布測定

參考YANG等[13]的方法并稍加修改，使用激光粒度儀對所有樣品進行平均粒度測定。為避免多個顆粒的相聚和散射產生影響，在分析之前將樣品用PBS(5 mmol/L，pH 7) 稀釋500倍。水相(PBS)和油相(核桃油)的折射率分別設定為1.330和1.434，每個樣品重復3 次。由粒度分布計算體積加權(d4，3)平均粒徑。d4，3值用于監測乳液聚集的穩定性。

1.3.4 乳液顯微鏡形貌觀察

將制備好的乳液用pH 7.0的PBS稀釋50倍，用漩渦振蕩器混勻后，用移液槍取40 μL滴于載玻片中心處，并從一側緩慢蓋上載玻片，采用光學顯微鏡觀察乳滴結構(100倍油鏡)。

1.3.5 Zeta電位的測定

參考XU等[14]的方法稍作修改，通過使用激光粒度儀測量所有樣品的Zeta電位(mV)。在測量之前用PBS(5 mmol/L，pH 7)稀釋乳液樣品，稀釋倍數為500倍，以避免多個顆粒的相聚。用電位杯量取1 mL左右樣品(25 ℃，溫度平衡時間為2 min)。每個樣品重復3次測量。

1.3.6 界面張力測定

根據LIU等[15]的方法進行改進，使用接觸角測量儀(XG-CAM系列)測定油-水界面處的界面張力。核桃油為油相，用PBS(5 mmol/L，pH 7)配制10 g/L SPI溶液作為水相。通過將不同濃度Tween 20分散在PBS(5 mmol/L，pH 7)中來改變水相的組成。將針尖端放置在光源和相機(CCD)之間的光學平板上;將水相倒入樣品杯中;將鉑片浸入水相中并將其拉至界面;在水相中將核桃油相緩慢加入，直到鉑片完全浸沒在油中。用數碼相機捕獲每個油滴的圖像，然后通過儀器制造商提供的Young-Laplace方程程序分析油滴的形狀來計算界面張力(γ)。

1.3.7 熒光光譜分析

根據ROY等[16]的方法稍作修改，測定內在的色氨酸熒光。將乳液樣品(10 μL)在PBS(5 mmol/L，pH 7)中稀釋，漩渦振蕩并靜置后分別加入到石英比色皿中，然后使用熒光分光光度計進行分析。參數設定為：色氨酸的發射光譜200～500 nm，掃描速度1 nm/s，激發波長297 nm。發射光帶寬20 nm，激發光帶寬10 nm。記錄光譜的最大發射強度用于分析。

1.3.8 油脂氧化初級產物的測定

根據DING等[17]的方法稍作修改，用油脂氧化初級產物即脂質氫過氧化物的含量來衡量乳液中油脂氧化的程度。將制備好的4種乳液樣品分別放置在10 mL帶蓋玻璃樣品瓶中，每類乳狀液各3份放置在 50 ℃恒溫避光的烘箱中進行烘箱加速試驗，間隔24 h測量1次。

取0.3 mL乳液與1.5 mL提取溶劑[V(異辛烷)∶V(異丙醇)=3∶1]混合，進行渦旋振蕩(10 s、3次)，在1 000×g下離心2 min，收集有機溶劑相。取200 μL加入到2.8 mL混合溶液[V(甲醇)∶V(丁醇)=2∶1]中，再加入15 μL 3.94 mol/L硫氰酸銨和15 μL亞鐵溶液(混合等體積的0.132 mol/L BaCl2和0.144 mol/L FeSO4過0.220 μm濾膜)制備得到。在室溫下靜置反應20 min后，使用酶標儀96透明孔板，在510 nm下測乳液樣品的吸光度。用氫過氧化物標準曲線來計算乳液樣品中脂質氫過氧化物值。

1.3.9 硫代巴比妥酸產物值的測定

根據SHEN等[18]的方法稍作修改。對于硫代巴比妥酸產物值(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)進行分析，將1.0 mL乳液樣品與2.0 mL含有150 g/L三氯乙酸和3.75 g/L TBA試劑混合，混勻后煮沸30 min。將冷卻的上清液用氯仿處理，并在2 200×g下離心20 min。在532 nm處測定上清液的吸光度，并根據由1,1,3,3-四乙氧基丙烷(μmol/L乳液)產生的標準曲線測定TBARS值。TBARS值以丙二醛的含量計，按公式(1)計算：

(1)

式中，A532, 溶液的吸光度；V, 樣品液體體積，mL；M,TBA的摩爾質量, 144.15 g/mol；m, 樣品質量, g；l, 光程1 cm；ε, 摩爾消光系數, 152 000 L/(mol·cm)。

1.3.10 數據統計及分析

所有實驗均設置3次平行實驗，利用Excel對數據進行整理，利用Origin 9.1軟件作圖，采用SPSS 22.0數據處理軟件對測定數據進行方差分析(analysis of variance，ANOVA)，利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進行分析及相關性分析，P<0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 乳液粒度和粒徑分布

乳液粒徑是衡量乳液穩定性的重要指標[19]。d4，3表示液滴體積平均直徑。乳液在均勻化過程中，Tween 20促進乳滴破裂并抑制乳滴的聚結，從而導致乳滴尺寸變小[20-21]。圖1-a表明，乳滴粒徑隨Tween 20 濃度逐漸增大而減小，表明吸附在油滴上的蛋白被逐漸置換，平均粒徑變小，這與袁媛等[22]研究結果相似。KALTSA等[7]研究表明，乳清蛋白乳化橄欖油液滴，在均質過程中其粒徑隨Tween 20的增大而減小，界面組成也隨之發生變化。實驗數據顯示：SPI+10 g/L Tween 20穩定乳液的平均粒徑為(243.07±0.043)nm，顯著低于10 g/L Tween 20穩定乳液的平均粒徑(286.23±0.031)nm(P<0.05)。該結果與界面張力測量結果一致，表明混合乳化劑(10 g/L SPI+10 g/L Tween 20)比單獨使用表面活性劑(10 g/L Tween 20)更能降低界面張力。乳液在儲存過程中沒有發生相分離，表明所有體系對乳滴的聚集和乳化都是穩定的。因此，Tween 20對SPI的界面置換不影響乳液的物理穩定性。先前的研究表明，當所有系統都包含相對較小的乳滴時，乳滴尺寸不會對乳液中的氧化產生重大影響[23-24]。

界面取代對乳滴粒度分布的影響如圖1-b所示，不含Tween 20的乳液粒徑較大，隨著Tween 20濃度增加，其分布趨于集中，表明乳液的物理穩定性隨Tween 20濃度的增大而增強。

圖1 Tween 20濃度變化對粒度分布(a)和乳液平均粒徑(b)的影響

2.2 乳液微觀形貌觀察

由圖2可知，乳滴都分布均勻且沒有發生聚集,當Tween 20濃度增大時，乳滴出現減小趨勢，可能由于與SPI分子相比,Tween 20具有更小的界面張力對油滴分子起到壓縮作用，從而出現了乳滴逐漸減小的情況[25]。

a-SPI;b-SPI+T5;c-SPI+T10;d-T10

2.3 Zeta電位分析

Zeta電位反映了溶液中粒子間的相互作用力，從而體現出乳液的物理穩定性。由圖3可知，在沒有Tween 20的情況下，液滴穩定后SPI帶負電荷，在pH 7時,電位值為-25.8 mV，這可以歸因于吸附蛋白質高于他們的等電點[26]。隨 Tween 20 濃度的不斷增加，乳滴電位的絕對值都呈現降低趨勢，帶電蛋白質逐步被 Tween 20 取代進入水相，因而導致乳滴界面電位絕對值減小，這與KALTSA[7]研究結果一致。在添加10 g/L Tween 20后，電位值為-16.7 mV，它的電位絕對值高于單純含10 g/L的Tween 20(電位值為-15.3 mV)，說明仍有少量蛋白質殘留在乳滴表面。

圖3 Tween 20濃度變化對乳液粒子電位的影響

2.4 Tween 20添加量對界面張力的影響

有研究表明，界面張力的大小可以反映乳液形成的難易程度，評估表面活性劑誘導在乳液中界面發生吸附和置換的行為[27]。由圖4可知，只含有10 g/L SPI的乳液界面張力約為(17.2±0.034) mN/m，隨著Tween 20從0.0增加到10 g/L，界面張力明顯下降(P<0.05)。10 g/L SPI+10 g/L Tween 20混合物的界面張力(10.3±0.026) mN/m低于10 g/L SPI(17.2±0.034)mN/m和10 g/L Tween 20(12.3±0.039)mN/m界面張力，表明蛋白質和Tween 20的混合物能夠更有效地降低油相和水相之間的疏水相互作用，與WAN等[2]實驗結果一致。在Tween 20質量濃度為10 g/L時，混合體系的界面張力與Tween 20的界面張力接近，說明界面主要被非離子表面活性劑所覆蓋，LOPEZ等[28]也得到了相同的結果。

圖4 Tween 20濃度變化對乳液界面張力的影響

2.5 熒光光譜分析

乳液中內在色氨酸熒光強度變化可以作為評估蛋白質氧化修飾的指標。由圖5可知，隨著儲存時間的增加，乳液樣品中蛋白質熒光強度在50 ℃黑暗環境中呈現出不斷減弱的趨勢，表明蛋白質逐漸被氧化發生結構修飾[29]，這與QIU等[30]研究結果相似。在含SPI的3個樣品乳液中，不含Tween 20的SPI乳液熒光損失最大(P<0.05)，Tween 20加入導致SPI被置換進入水相，因而導致油脂氧化速率變低，說明吸附的蛋白質可能在乳劑制備過程中抑制了油脂氧化[31]。隨著乳狀液中Tween 20濃度增加，蛋白質氧化程度再次降低，表現為貯藏過程中熒光損耗降低[32]。NIU等[33]研究了脂質氧化產物丙二醛使乳清分離蛋白熒光猝滅，熒光強度降低，表明蛋白質分子與Tween 20發生置換后，油脂氧化情況也隨之改變[34]。相比于含有Tween 20的乳液體系，不含 Tween 20的SPI的乳液氧化穩定性較好， 這與YANG等[1]和BERTON等[35]研究結果一致。

圖5 Tween 20濃度變化對乳劑熒光強度的影響

2.6 Tween 20 添加量對油脂氧化穩定性的影響

2.6.1 油脂初級氧化產物分析

由圖6看出，隨著儲存時間的增加，4種樣品的氫過氧化物含量都在逐漸增加；含有Tween 20的乳劑氫過氧化物含量增加更快，油脂氧化穩定性降低。吸附在界面上的SPI逐漸被Tween 20取代進入水相，表明發生界面取代后，乳液氧化穩定性降低，這與KIOKIAS等[36]的研究結果一致。

圖6 Tween 20濃度變化對乳液中氫過氧化物的影響

結果表明，SPI在抑制脂質氧化方面比Tween 20更有效，與KIOKIAS等[36]研究結果一致。Tween 20含量的增加導致O/W乳液的氧化穩定性明顯降低，這可以從脂質過氧化氫實驗結果得到證明[36]。

2.6.2 TBARS分析

TBARS值可測定乳液中次級氧化產物的含量。由圖7可知，在烘箱加速實驗中，TBARS的變化趨勢和氫過氧化物值的趨勢相似，隨著儲存時間增加，TBARS值逐漸升高，表明油脂的氧化速率增大。

圖7 Tween 20濃度變化對TBARS濃度的影響

而Tween 20的加入使TBARS值增加，并且在儲存后期曲線變陡，說明乳液氧化情況加劇。以上這些結果表明SPI抑制油脂氧化比Tween 20更有效，這與VIREN[37]、HAAHR[38]等研究結果一致。Tween 20比例的增加導致了乳劑的氧化穩定性明顯下降。

3 結論

本實驗研究了用Tween 20與SPI制成的乳液體系對乳液的物理和氧化穩定性的影響。結果表明，在O/W乳液中油脂和蛋白發生氧化并且受到蛋白質分子位置的影響。Tween 20存在時，蛋白質分子從油滴表面被部分取代，也改變了它們的氧化敏感性。乳滴粒徑和顯微鏡觀察結果表明，隨Tween 20濃度逐漸增大，乳滴不斷減小，界面中的SPI不斷被置換下來。乳滴電位的絕對值和界面張力都呈現降低趨勢，表明蛋白質和Tween 20的乳液體系能更有效地降低油相和水相之間的疏水相互作用，表明在添加了Tween 20之后，物理穩定性較好。烘箱加速實驗表明，在儲存期間蛋白質熒光強度不斷變小，表明Tween 20在乳液中界面發生吸附和置換。與含有Tween 20的乳液體系相比，只含SPI的乳液脂質氧化速率最低，說明吸附的蛋白質可能在乳劑制備過程中抑制了脂質氧化。4種樣品的氫過氧化物和TBARS值都在增大，但Tween 20的加入，使乳液中的氫過氧化物含量增加更快。這表明在儲存過程中，油脂氧化穩定性降低，而Tween 20的加入使其穩定性加速降低。Tween 20與蛋白質共存體系比純 Tween 20體系的乳液更穩定。以上結果為含小分子表面活性劑的蛋白質乳液在食品加工中的應用提供參考。